肠球菌的庆大霉素高耐性及传递

目的 对所分离的菌株的耐药性、庆大霉素高耐性传递、庆大霉素高耐性质粒及庆大霉素耐药基因的型别进行初步探讨。方法 从临床分离的33株肠球菌和一株国际标准株ATCC29212作种的鉴定,其中粪肠球菌（E.faecalis)25株,屎肠球菌（E.faecium)5株,肠肠球菌（E.hirae)2株,鸟肠球菌（E.avium)和坚韧肠球菌（E.durans) 各一株。结果 对34株肠球菌作药敏检测发现大多数菌株都耐两种或两种以上的抗生素,三耐或三耐以上株占67．5％。庆大霉素高耐株（HLGR,MIC＞2000mg/L)23株,占67．5％,红霉素（Ery)、四环素（Tc)耐药率与HLGR相当。对氨苄青霉素（AP）、氯霉素（Cm)、利福平（Rif)耐药率较低。本实验未检测到万古霉素（Van) 耐药株（VRE）。以一株粪肠球菌EF5（Gms,无质粒带）和一株屎肠球菌EFR（Gm^s,无质粒带）诱变为利福平抗性（RIF^r),作受体菌,以14株HLGR为供体菌,通过液体法和平板法作接合传递,实现了耐药性在种间和种内的不同频率的传递。其中4株供体菌的耐药性可以通过液体接合法在同种间进行传递,且传递频率较高,经提取质粒分析发现都有大的质粒带（＞45kb)的转移。但在不同种间耐药性不能通过液体法传递。以一株HLGR EF1（Gm^rEry^rTc^r,含六条质粒带）的质粒DNA为供体DNA,分别以EFR和EF5为受体菌进行电击转化,获得两株含单条质粒带的庆大霉素高耐的转化子G3和G4,G3的质粒pG301(14.5kb)为EF1本身所含有,G4的质粒pG401(约35kb)为EF1所无,以pG301和pG401为供体质粒DNA对EF5和EFR进行电击转化,可重复地获得含有相应质粒带的Gm^r的转化子。对G3和G4作叮啶橙质粒脱失试验,获得两株不含质粒带的庆霉素敏感的菌株GF301和GF401,说明pG301和pG401是含有庆大霉素耐药基因的质粒。以Rif^s的转化子G4与Rif^r的受体EFR作平板接合可实现Gm^r的传递,而G3则不能。经Bgl Ⅱ,EcoR I,Hae Ⅲ和Hind Ⅲ酶切分析发现两者带型相似,对两者作初步药敏分析未发现差别。以一株金黄色葡萄球菌6（Fu^rGm^s为受体菌,以3株HLGR为供体菌通过平板法作接合传递,以pG301和pG401为供体DNA进行电击转化,均未发现Gm^r的转移。以pG301为模板DNA,设计合成6‘－N－氨基糖苷乙酰转移酶－2”－O－氨基糖苷磷酸转移酶双功能酶基因aac(6‘)aph(2″）外侧引物,进行PCR扩增,扩增出一条长约1.6kb的扩增产物,并经不完全测序分析确定为双功能酶基因。结论 通过单酶切和双酶切分析,对pG301初步绘制了包括EcoR I一个位点、Hae Ⅲ两个位点和Hind Ⅲ四个位点的粗略的酶切图谱。     

HBV—前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2.2.15细胞转？…

目的：探索最佳ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染２．２．１５细胞的转化条件。方法：构建含ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒后,通过控制质粒ＤＮＡ浓度、电压、电容、时间、温度等实验条件进行电转染观察转染细胞生长情况。结果：在电压２１０Ｖ、电容９７５ｕＦ、温度４℃、ＤＮＡ终浓度在０．１２５μｇ／μｌ至０．７５μｇ／μｌ之间时,细胞转染生长情况最佳。结论：上述优化实验条件,可明显提高Ｈ     

P选择素凝集素样区和表皮生长因子样区的原核表达质粒构建

Ｐ选择素 (Ｐ ｓｅｌｅｃｔｉｎ)作为血小板 /内皮细胞活化分子及粘附受体 ,在早期炎症、血栓形成、肿瘤转移等发挥重要作用[1 5] ,已成为近年研究热点。然而有关Ｐ选择素分子表位结构与其功能关系研究将有助于进一步阐明Ｐ选择素生理、病理意义及其参与疾病发病机制的作用 ,进而为针对其临床特异性抗粘附治疗奠定基础。为此我们采用基因工程技术 ,成功地构建了Ｐ选择素分子表位片段 ,为制备上述表位特异性单克隆抗体 ,进一步探讨Ｐ选择素表位结构与其功能关系提供基础。材料与方法一、材料1.菌种。克隆菌为大肠杆菌Ｃ60 0 ;2、质粒。表达质…     

刚地弓形虫ROP10-ROP18真核表达载体的构建与鉴定北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白10(ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXDROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白。方法设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点中,构建单价质粒pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18,然后将ROP18基因插入pVAXD-ROP10中构建双启动子真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18。经PCR和双酶切验证后将pVAXD-ROP10-ROP18转染至HeLa细胞内,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板分别进行ROP10基因和ROP18基因的RT-PCR鉴定;采用间接免疫荧光试验(IFA)检验ROP10和ROP18蛋白表达情况。结果成功克隆ROP10、ROP18基因片段并构建了重组质粒pVAXDROP10-ROP18,测序、双酶切和PCR验证重组质粒构建正确。分别将3种重组质粒转染至HeLa细胞后经RT-PCR鉴定,pVAXD-ROP10-ROP18组可同时扩增出1 761bp(ROP10基因)和1 665bp(ROP18基因)2个片段,而pVAXDROP10组和pVAXD-ROP18组分别扩增出1 761bp和1 665bp的目的片段;IFA显示pVAXD-ROP10组和pVAXDROP18组均有绿色荧光,即分别表达ROP10和ROP18蛋白。结论成功构建重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18、pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18质粒可在真核细胞中分别表达ROP10和ROP18两种蛋白。     

蚯蚓溶栓酶重组质粒遗传稳定性的研究

通过蚯蚓溶栓酶重组质粒 pBV2 2 0 -P30 在大肠杆菌DH5α中 2 0代培养 ,提取每一代质粒 ,进行双酶切实验 ,利用Agarose电泳 ,在紫外灯下观察 ,得到每一代质粒酶切结果 ,确定蚯蚓溶栓酶重组质粒 pBV2 2 0 -P30 在大肠杆菌DH5α中稳定遗传的代次。结果表明 :蚯蚓溶栓酶重组质粒可以在大肠杆菌中稳定遗传 1 3代 ,在 1 3～ 2 0代外源的蚯蚓溶栓酶基因丢失或复制量不足 ,在Agarose电泳上不能显示     

MNNG诱导猴肾vero细胞中的非定标性突变

本研究用甲基硝基亚硝(MNNG)单独处理猴肾细胞后移去残余的诱变剂,然后将穿梭质粒pZ189(含有靶基因supFtRNA基因)引入细胞中复制,并在大肠杆菌MBM7070中筛选突变子。结果显示:0.2μmol/L MNNG处理组的突变频率较自发突变频率增加了3.1倍,而0.2和2μmol/L MNNG处理组点突变频率分别为12.2×10~(-4)(43/35376)和6.2×10~(-4)(22/35712),比自发点突变频率2.1×10~(-4)(10/47741)分别增加了5.8倍和2.9倍,其卡方检验的P值均小于0.01。本研究首次证实了哺乳类细胞中存在着非定标性实变。     

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术,即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列,然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中,以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定,确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。     

质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+转运的影响

目的：观察ＤＮＡ与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网,并用４５ＣａＣｌ２作为示踪剂,观察质粒ＤＮＡｐｃＤＮＡ３和ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ｃａ２＋摄取,呈明显的量效关系,并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒ＤＮＡ可影响肌质网钙转运功能。     

赖型钩体pDC38核酸序列测定及其与流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ompL1核酸序列的类似性匹配

为了探讨赖型钩体 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段基因组 Ｄ Ｎ Ａ 编码、位置与ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因的关系,作者采用在流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ｏｍ ｐ Ｌ１ 首尾区段设计一对引物,以 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段作模板进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增、测定和类似性匹配（ａｌｉｇｎｍ ｅｎｔ）。结果发现：ｐ Ｄ Ｃ３８ 含有 ２．７ｋｂ 和３．０ｋｂ 两个插入片段,３．０ｋｂ 片段含有 １ 个ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因全拷贝。结论：类似性匹配表明,ｐ Ｄ Ｃ３８ 和ｏｍ ｐ Ｌ１ 相同碱基８６４ 个（９０％ ）,碱基变异（不配对）９６（１０％ ）个, ｐ Ｄ Ｃ３８ 可用于钩体诊断、分类、鉴定、疫苗和发病机理的研究。     

用穿梭质粒pWB1研究黄曲霉素B1,苯并(α)芘在人FL细胞中的诱变性

作者以β－萘黄酮诱导ＦＬ细胞表达细胞色素Ｐ４５０同工酶系,利用穿梭质粒ｐＷＢ１研究了黄曲霉Ｂ１和苯并（α）芘在人新生儿羊膜上皮ＦＬ细胞中的诱变作用。结果：均以比自发突变频率（７．６１×１０－６）高两个数量级（１０－４）的频率,检出了黄曲霉Ｂ１和苯并（α）芘诱发的ＳｕｐＦ基因突变子,其中黄曲霉素Ｂ１表现了明显的剂量效应,从而为穿梭质粒ｐＷＢ１结合β－萘黄酮诱导ＦＬ细胞表达细胞色素Ｐ４５０同工酶系在ＦＬ细胞内检测间接致癌物的可行性提供了证据。