Construction of p100 Knock Down Stable HepG2 Cell Line with a p100 shRNA Expression Lentiviral System

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系.方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建p LKO.3G-p1001慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定.将构建好的p100 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒.运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果.结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株.慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90％以上细胞发出绿色荧光,Western blot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系.     

AmpCβ-内酰胺酶的产生机制及检测方法学进展

AmpCβ-内酰胺酶存在于许多革兰氏阴性菌中,最初由染色体介导,目前已转移到质粒上。它与超广谱p一内酰胺酶(EsBLs)的最主要表型区别是耐药谱的扩大且不能被克拉维酸抑制。诱导表达是染色体AmpC酶表达的典型模式,受染色体amp操纵子调控。基因突变造成的高产表达和新型质粒AmpC酶的不断出现威胁着感染性疾病的治疗。目前检测AmpC酶的方法有纸片诱导、抑制剂协同、三维试验、等电聚焦、基因检测等。需要发展简便、快速、准确的检测技术应用于临床实验室,指导合理正确使用抗生素,以控制AmpC酶所致耐药性的蔓延。     

阴沟肠杆菌质粒介导耐喹诺酮类药物的机制研究

目的了解深圳地区阴沟肠杆菌中qnrA基因的流行情况、基因定位及其介导喹诺酮耐药性产生的机制。方法收集临床分离的阴沟肠杆菌45株,采用PCR法结合测序的技术筛查qnrA基因,大质粒提取技术、Southern杂交和接合传递试验进行质粒定位,琼脂对倍稀释法进行药物敏感性检测。结果45株阴沟肠杆菌中,7株PCR法及测序证实为qnrA基因。7株菌中6株菌所携质粒被成功提取并进行Southern杂交,qnrA基因定位于80~200kb大小的低拷贝数天然质粒上。4株菌成功进行接合传递试验,使接合子对环丙沙星的MIC值提高了32~64倍。结论质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA在深圳地区阴沟肠杆菌中具有较高的流行率,可能是导致阴沟肠杆菌对喹诺酮类抗菌药获得性耐药的重要原因。     

封闭野生型p53表达使卵巢癌细胞药物敏感性增加的机制

目的：观察p53状态对卵巢癌细胞的顺铂药敏性的影响。方法：将pCMV-MDM2质粒转染于p53状态为野生型A2780卵巢癌细胞系，同时转染pCMV空载体作为对照。通过Western blot证明转染后细胞在受到损伤时p53表达被封闭。通过集落形成实验检验A2780在p53状态改变前后细胞药敏性，并通过流式细胞技术检测其细胞周期的改变，原子吸收光谱仪测定DNA-顺铂结合物以检验其核苷酸切除修复功能是否丧失。结果：(1)p53失表达的细胞集落形成率与对照组相比，在给予顺铂后明显下降，提示对顺铂的药物敏感性增加。(2)实验组细胞在给以顺铂治疗后，出现了明显的S期阻滞，而在p53功能完整的对照组细胞却主要出现G2／M期阻滞。(3)给予顺铂后，所有细胞的铂吸收量相同。p53被封闭后，细胞的铂结合量增加。结论：封闭野生型p53表达增加了卵巢癌细胞A2780对顺铂的敏感性，这是由于p53参与细胞周期检查点的调节和DNA修复过程而致。     

靶向mdr1基因转录小发夹RNA重组质粒的构建和序列分析

目的 构建针对多药耐药基因(mdr1)编码区的发夹状RNA重组质粒栽体pshRNA-mdr1,并行序列分析,为下一步逆转肿瘤的多药耐药性打下基础。方法设计含19-21bp mdrl编码基因片段及中间以4个bp间隔的反向重复序列,经退火形成互补双链,克隆至转录栽体pTZU6 1上,转化JM109菌株,提取重组质粒酶切鉴定并序列分析。结果将合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列。结论靶向mdr1基因发夹状RNA干扰重组质粒的成功构建,可进一步研究其对mdr1 mRNA转录的抑制,达到逆转肿瘤的多药耐药性的目的。     

尿源产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌质粒介导氟喹诺酮类耐药性研究

目的 研究尿源性产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株中qnrA、qnrB以及qnrS的流行情况和耐药特征,为控制产ESBL细菌感染提供实验依据.方法 琼脂稀释法测定喹诺酮类及氨基糖苷类对46株尿源产ESBL细菌的最低抑菌浓度.PCR法检测qnrA、qnrB以及qnrS的存在情况.结果 46株产CTX-M型大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、庆大霉素和阿米卡星的耐药率分别为26.1％、19.6％、13.0％、60.9％和43.5％.46株大肠埃希菌中检出2株含qnrB(4.3％),未检出qnrA和qnrS.结论 尿源性产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌中有qnrB的存在,且对喹诺酮类以及氨基糖苷类药物耐药性严重,需参考药敏结果,不宜经验性选择喹诺酮类药物及氨基糖苷类药物治疗产ESBL且qnr基因阳性的大肠埃希菌尿路感染及尿源性血流感染.     

重组质粒导入真核细胞的两种方法比较

目的：比较糖化多聚赖氨酸介导和电穿孔两种方法将重组质粒导入真核细胞的优缺点。方法：用最佳电压、电容、温度、DNA浓度进行电穿孔转染,或者先使重组质粒与糖化多聚赖氨酸电性结合后,再与2.2.15细胞共同温育的方法,分别将pcEP4-aC重组质粒导入2.2.15细胞,经潮霉素筛选,比较两种方法的优劣。结果：两种方法都能成功地将重组质粒导入2.2.15细胞,但糖化多聚赖氨酸介导者,细胞生存时间较长。结论：糖化多聚赖氨酸导向配体具有良好的导入重组质粒进入肝细胞的功能,且更适合于应用。     

人乳头瘤病毒在宫颈癌组织中存在状况的初探

采用Southern吸印杂交技术,对人乳头瘤病毒16型(HPV-16)在人宫颈癌活检组织中存在的状况进行了研究。结果提示:①存人宫颈癌组织中存在着HPV-16 DNA序列,并且HPV-16 DNA是整合在肿瘤细胞的基因组中(有的也带有游离的片段)整合的位点是随机的;②不同的人宫颈癌组织HPV-16DNA的含量不同,酶切片段的大小也不同;③HPV-16具有诱导NIH/3T3细胞发生转化的功能,病毒基因亦是整合在细胞染色体DNA中。     

OPCML基因的克隆

目的:建立OPCML真核细胞表达质粒.方法:利用计算机软件Vector NTI,根据GenBank中OPCML的序列,用RT-PCR法从小鼠大脑组织中扩增OPCML基因全长片段,将其克隆入真核细胞表达质粒pcDNA3,建立OPCML的表达质粒pcDNA3-OPCML,后将其转染入人胚胎肾细胞(293T),用Western blot检测OPCML蛋白在293T中的表达.结果:OPCML能被成功地从正常组织中克隆,构建了真核细胞表达质粒pcDNA3-OPCML,测序表明其携带有正常OPCML的全长序列;转导入人类细胞后有OPCML蛋白的高量表达.结论:pcDNA3-OPCML携带有正常的OPCML全长基因序列,其能在真核细胞中高量表达功能蛋白.     

EBV-LMP1与HSP90真核双表达质粒的构建及体外表达

目的从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)与热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核双表达质粒pIRES-LMP1-HSP90β,并检测其在体外的表达。方法提取鼻咽癌组织总RNA,逆转录PCR获得LMP1基因片段和HSP90β基因片段,将二者连接于真核双表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Westernblot检测LMP1和HSP90β的表达。结果核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该双表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1和HSP90β分子。结论实验所构建的pIRES-LMP1-HSP90β双表达质粒能在体外同时表达LMP1和HSP90β分子。