不同类型的HBsAg真核表达质粒在EBV永生化B淋巴母细胞中的表达

目的 探讨3种不同类型的HBsAg真核表达质粒在EBV永生化B淋巴母细胞中的表达。方法 用3种不同类型的质粒载体分别构建乙型肝炎表面抗原（HBsAg)真核表达质粒（pCI-S,pMEP4-S,pLXSN-S)；然后用阳离子脂质体介导的转染法分别转染正常人EBV永生化的B淋巴母细胞，经G418或HygromycinB筛选出抗性细胞克隆，用RT-PCR检测抗性细胞总RNA中目的基因在转录水平的表达；用ELISA检测抗性细胞培养上清和细胞裂解液中HB-sAg的含量。结果 3种不同类型HBsAg重组表达质粒转染的EBV永生化B淋巴母细胞，在转录水平上，可检出HB-sAgmRNA的表达；在蛋白水平上，细胞增养上清和细胞裂解液均可检出HBsAg；而以EB病毒表达质粒pMEP4-S表达最高，真核表达质粒pCI-S和逆转录病毒表达质粒pLXSN-S表达HBsAg的量无明显差异。结论 3种不同类型的HBsAg真核表达质粒均可在EBV永生化B淋巴母细胞中稳定表达，EB病毒表达质粒pMEP4-S表达的HBsAg明显高于真核表达质粒pCI-S和逆转录病毒表达质粒pLXSN-S。     

绿脓杆菌耐药性质粒(R质粒)的研究进展

绿脓杆菌是引起医院内感染的重要条件致病菌[12],近年来在临床上引起的感染日益增多,且随着抗生素的大量使用,其耐药范围及耐药水平不断上升,故该菌作为重要的条件致病菌之一而愈来愈受到人们的关注.该菌对多种抗菌药物有耐药性,且常表现为多重耐药,随着绿脓杆菌耐药菌株的不断出现和耐药水平的升高,给临床治疗带来了极大困难.故研究其耐药机理及选择有效手段阻止和控制耐药株的蔓延已成为当今急待解决的问题[3].实验证实,多重高度耐药绿脓杆菌的抗药性与耐药质粒有直接关系,临床分离的绿脓杆菌90%以上菌株携带有R质粒[4].R质粒对抗菌药物的耐药性主要是通过产生各种钝化酶(灭活酶)而实现,此外R质粒还可通过改变细胞膜的通透性而影响药物的渗透性.     

pCD-rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF.通过Liofectin介导将pCD-rbFGF转染兔成骨细胞,经免疫组化检测证实兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达.提示该bFGF真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究.     

乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 采用常规PCR法扩增S、前S2－S、前S1－前S2－S片断,利用重叠PCR法扩增出前S1－S片断后,分别插入Rc/CMV及pSG5UTPL/Flag载体质粒中,并在其ATG起始密码前加入KOZAK序列后转染SP2／0细胞,Western-Blot杂交检测所表达蛋白,并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果 插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的编码基因一致,Western-Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论 获得了8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的真核细胞表达质粒。     

莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的　为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法　采用 377型 DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒 p BX1的插入片段进行 DNA序列测定 ,并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒 p BX1在大肠杆菌中进行诱导表达 ,并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果　1重组质粒 p BX1插入片段大小为 477bp,其核苷酸序列与文献报道的 p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异 ,2成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱 ;3重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了 2 9kd的融合蛋白 ;4Western- blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论　该研究成功地对莱姆病螺旋体 83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达 ,为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分枝菌Ag85B DNA疫苗免疫对小鼠结肠SIgA及菌群的影响北大核心CSCD

目的 探究结核分枝杆菌Ag85B的真核表达质粒pcD-Ag85B经肌肉免疫后对小鼠结肠黏膜SIgA及菌群的影响。方法 以pcDNA3.1+为真核表达载体,将信号肽基因和编码Ag85B的Rv1886c基因共963 bp核苷酸序列连接到pcDNA3.1+,构建真核表达质粒pcD-Ag85B。通过双酶切和测序鉴定无误后,将pcD-Ag85B重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)并验证其表达。采用微针注射法将pcD-Ag85B重组质粒经大腿肌肉免疫C57BL/6J小鼠;初免后42 d收集小鼠粪便及结肠黏液进行16S RNA高通量测序和菌群结构分析,并测定SIgA特异性抗体效价。结果 成功构建真核表达质粒pcD-Ag85B并检测到Ag85B蛋白的特异性表达,蛋白相对分子质量约为35×10~3,与预期相符。一免疫后42 d,Ag85B组小鼠结肠厚壁菌门-乳杆菌属的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)丰度与对照组相比显著增高(均P<0.05);肠粘膜SlgA效价为1∶4500。结论 成功获得表达Ag85B蛋白的真核表达质粒,用该质粒免疫能诱导小鼠结肠粘膜产生体液免疫效应,改善结肠益生菌-乳酸杆菌群丰度。     

氯化锂离心纯化质粒DNA方法的建立及其效果评价

本文建立了一种采用氯化锂离心纯化质粒ＤＮＡ的方法。该法不需要特殊的仪器设备和昂贵的试剂材料，操作简便易行。用此法对ｐＵＣ和ｐＧＥＭ等多种系统的质粒进行了提取纯化。结果表明：纯化的质粒ＤＮＡ无ＲＮＡ、蛋白质和染色质ＤＮＡ污染，其得率与氯化铯超离心法相近；酶切效果良好；可直接用于哺乳动物细胞的基因转移并获得有效表达。     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.