小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45     

抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的 构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT。方法 用限制性内切酶EcoRⅠ酶切抑癌基因FHIT的克隆载体pGEM-FHIT获得FHIT基因片段,长度为0.9kb,将其插入真核表达载体pHCMVsp1A CMV启动子的下游,用HindⅢ酶切鉴定FHIT基因插入方向。结果 PCR扩增及EcoRⅠ、HindⅢ酶切鉴定证实FHIT基因以正确方向插入表达质粒pHCMV1A中。结论 成功构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT,为研究FHIT的抑癌作用提供有效的分子工具。     

Rb蛋白在多发性骨髓瘤细胞中的表达及临床意义

目的：探讨多发性骨髓瘤（MM）细胞Rb蛋白的表达与临床化疗的关系,方法：采用免疫细胞化学S－P法,借助抗Rb蛋白单抗,对47例多发性骨髓瘤患者进行了检测,结果：47例中有11例（11／47）呈阴性表达,阴性表达率30．6％,免疫人型各亚型之间差异显著无显著性（P＞0．05）,所有患者采用常规化疗方案化疗个疗程,Rb蛋白阴性组化疗有效率为36．4％,而Rb蛋白阳性组总有效率为77．9％,两组比较差异显著（P＜0．05）,多变量分析显示,除去血清β2－微球蛋白,乳酸脱氨酶,肌酐三因素对化疗结果的影响,Rb蛋白阴性可作为影响化疗疗效的独立负性因素,结论：Rb蛋白阴性表达在多发性骨髓瘤细胞中较易见,且Rb蛋白不表达者对化疗疗效差。     

使用人粘附分子—2启动子的衰变加速因子重组基因表达载体的构建及意义

目的：构建含人粘附分子-2（ICAM-2）启动子的人衰变因子（DAF）重组基因的真核细胞表达载体,运用于转基因动物克服异种器官排斥的研究。方法：双酶切本室巳构建质粒pGEM-7Zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAFcDNA序列的插入片段（3.7Kb）;双酶切pcDNA3真核表达载体,得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段DNA作为载体序列（4.4Kb）;两段DNA进行连接反应后转化细菌;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。根据人的ICAM-2启动子、DAFcDNA序列,设计引物行PCR特异扩增检验。结果：特异性3组酶切重组表达载体,产生符合设计的相应条带;PCR扩增出特异的318bp及1.7Kb的DNA片段,符合设计要求。结论：含人ICAM-2启动子的DAF重组基因表达载体获得成功。     

恶性疟原虫pGST—HTl融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的 构建pGST—HT1融合表达载体,并观察其在大肠杆菌中的表达情况。方法 基因扩增,融合表达载体的构建,SDS—PAGE电泳和Western blot分析。结果 对重组质粒进行酶切鉴定证实HT11片段已克隆到pGSTag的EcoRI和Sall位点之间。表达产物经SDS—PAGE电泳后显示在相对分子质量82000处出一条新生蛋白带,与HT1／GST(56／26)融合蛋白大小一致,提示成功表达HT1融合蛋白。Western印迹杂交结果也显示在相对分子质量82000处出现阳性着色条带。结论 本实验成功构建pGST—HTl表达载体,并诱导表达出HTl融合蛋白,为HTl蛋白功能和免疫原性的进一步研究奠定了基础。     

含不同启动子的腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体基因在心肌细胞的表达

目的：观察不同的启动因子cmv,mlc-2v对腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体（β2－AR）基因在大鼠心肌细胞中表达,方法：分别构建cmv,mlc-2v启动子并携带人β20－AR基因的重组腺病毒Adcmvβ2AR,Admlc,β2AR,用以感染心肌细胞,并检测心肌细胞对人β2－AR基因的表达及cAMP的含量,结果：经RT－PCR,Western免疫印迹分析证帝感染的心肌细胞均表达人β2－AR,放射性配基检测显示含mlc-2v启动子Admlcβ2AR感染的心肌细胞β2－AR密度低于含cmv启动子的A β2AR感染组（P＜0．01）,经10umol/L异丙肾上腺素作用,感染组的心肌细胞内cAMP含量明显高于对照组,感染组间存在明显差异（P＜0．01）,结论：含不同启动子的腺病毒载休感染心肌细胞后均可表达具有生物活性的人β2－AR,但两者存在差异。     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的:用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原,建立诊断TTV 感染的特异性方法. 方法:采用PCR方法扩增TTV ORF2基因,将之插入到测序质粒载体中进行测序,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30,并转化大肠杆菌M15菌株,进行诱导表达.用SDS-PAGE分析表达产物.表达产物经Ni-NTA柱层析纯化后,得到纯度为90%的ORF蛋白抗原.用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot Blotting分析.结果:经IPTG诱导后,筛选出2株高表达株. 结论:该蛋白具有良好的抗原活性.     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体。方法以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT。质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达。结论成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体。     

人胰岛淀粉样多肽沉淀细胞模型的体外构建

目的构建人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)基因真核表达载体,并在无内源性IAPP表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株上进行体外表达实验,建立可产生hIAPP沉淀的细胞模型。方法应用RT-PCR技术扩增得到hIAPP cDNA,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-IAPP;随后用lipofectamine 2000介导转染CHO细胞,以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达,以Thiaflavin S染色的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果构建的pcDNA 3.1-hIAPP真核表达体系成功转染体外培养的CHO细胞,目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,转染后培养48 h内的CHO细胞用Thioflavin S染色,与阴性对照相比较,证实有hIAPP的表达而导致细胞内淀粉样沉积发生。结论构建了hIAPP真核表达质粒,并成功在体外表达,从而建立了可产生IAPP淀粉样沉淀的体外哺乳动物细胞模型,为进一步研究胰岛淀粉样沉积的发病机制提供了良好的平台。     

CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建CYP2 B6基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta2(DE3)pLysS]中高效表达重组蛋白。方法:以质粒为模板,用PCR技术扩增出CYP2 B6基因,并将其分别插入pET-22b( )、pET-28b( )和pET-32a( )质粒中,经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta2(DE3)pLysS,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果:经PCR、测序鉴定,构建了CYP2 B6基因表达质粒;采用考马斯亮蓝染色法检测重组蛋白表达,pET-22b( )-CYP2 B6未见目的蛋白表达;pET-28b( )-CYP2 B6有目的蛋白表达,约占蛋白总量的5%;而pET-32a( )-CYP2 B6可以高效地表达CYP2 B6,在低浓度(50μmol/L)IPTG诱导3 h后,所表达的CYP2 B6蛋白约占细菌总蛋白的30%;质谱分析结果进一步证实所表达的蛋白为CYP2 B6。结论:成功地使CYP2 B6基因在原核系统中高效表达。