针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其沉寂效应检测

目的：设计并构建针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达载体，观察其对转染细胞中的caspase-8的抑制作用。方法：化学合成用于产生针对caspase-8的发夹状的RNA的寡核苷酸，将合成的寡核苷酸链退火形成双链，连接入经Hind Ⅲ和Bgl II双酶切后的pSUPER真核表达载体。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞，RT—PCR、间接免疫荧光检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果。结果：构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER—C1和pSU—PER—C2，并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase-8基因的干涉作用，而且pSUPER—C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER—C2。结论：成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体，转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达。     

HBV重组抗原表位抗原性的研究

目的 在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达HBV抗原表位,并对其抗原性进行研究.方法 人工合成编码HBV "a"抗原决定簇表位中24个氨基酸(S124-147)的寡核苷酸序列,克隆入外源抗原表位表达载体系统FHV-RNA2-I3位点,构建重组质粒,在原核pET系统(BL21细胞)中表达.以表达产物为包被抗原对其抗原性进行研究.结果 嵌和蛋白与抗-HBs血清可发生特异性结合反应.结论 在外源抗原表位表达系统中表达的HBV抗原表位具有良好的抗原性.     

RNA干扰体外抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 针对乙型肝炎病毒(HBV)prec/c区构建shRNA表达载体,观察shRNA表达载体对HBV抗原表达的抑制作用,为运用RNA干扰(RNAi)技术治疗乙型肝炎奠定基础.方法 运用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切,测序鉴定确认后,与1.5倍HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染Hela细胞,并于转染后72 h,用微粒子酶免疫实验(MEIA)分别检测细胞上清液和细胞裂解液中HBsAg和HBeAg表达水平;用半定量PCR检测prec/c mRNA的转录情况;分析shRNA表达载体对HBe/HBs抗原表达的抑制情况.结果 成功构建了针对HBV prec/c区的shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6及无关shRNA表达载体psiC;筛选到对HBeAg有明显的抑制作用的psiHBV4载体,同时其对HBsAg的表达有促进作用;psiHBV5和psiHBV6对HBeAg的抑制作用相对较弱,其对HBsAg的表达也有不同程度的促进作用;无关干扰对照psiC对HBV两种抗原的表达均无显著抑制作用.结论 成功构建带U6启动子的shRNA表达载体并初步筛选到可显著抑制HBeAg表达的psiHBV4;本研究设计的3个靶向序列中,只有一个序列有大约70%的抑制率,而另外两个序列的抑制率相对较小,说明RNA干扰作用有较强的序列依赖性;无关干扰序列psiC几乎无干扰作用,说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性.以上结果为应用RNAi治疗乙型肝炎奠定了一定的基础.     

survivin的siRNA靶向干扰膀胱癌的实验研究

目的实验研究靶向转染survivin的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对膀胱癌生物学行为的影响。方法设计1对survivin编码基因序列特异的siRNA，用脂质体转染T24膀胱癌细胞株。采用流式细胞术检测转染效率和细胞凋亡；荧光实时定量PCR检测干扰前后survivin的mRNA表达；用survivin的siRNA片段插入空载体后建立重组载体pRNAT-U6、1／Neo-survivin。结果脂质体转染T24细胞后的转染效率为92．3％；survivin编码基因序列特异的siRNA能有效下调survivin基因的表达，呈时间和剂量依赖性，最大效应浓度为100nmol／L，此时survivin表达水平下调了75．91％，并显著地抑制了细胞生长，抑制率达55．29％，差异有统计学意义（P〈0．01）；细胞凋亡率亦增至45．70％，与对照相比差异有统计学意义（P〈0．01）。用限制性内切酶将空载体线性化，T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中，对该重组表达载体进行鉴定，获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-survivin。结论siRNA．survivin能显著下调膀胱癌细胞survivin基因表达水平，促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，可能成为膀胱癌基因治疗的新工具。成功构建的靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体为进一步应用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

骨内植入式药物缓释系统载体材料研究现状及进展

植入式药物缓释系统在治疗骨科感染、肿瘤等方面具有良好的作用。随着组织工程学的进展,研制了不同的材料作为骨内植入式药物缓释系统的载体,拟对骨内植入式药物缓释系统载体材料研究现况及进展进行综述。     

pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1融合蛋白诱导特应性抗肿瘤免疫应答的研究

目的:构建重组表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1,研究人B7.2/MAGE-1基因修饰的食管癌细胞作为瘤苗的抗肿瘤作用.方法:通过RT-PCR扩增B7.2和MAGE-1的cDNA,以pEGFP-C3为载体,构建pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1重组载体,通过脂质体转染技术转染人食管癌细胞株EC9706,外周血来源的树突状细胞(DC)负载肿瘤抗原后,与自体T淋巴细胞共培养3天,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对转染和未转染pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的食管癌细胞EC9706的杀伤活性.结果:CTL对转染pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的肿瘤细胞的杀伤活性大于转染pEGFP-C3和未转染细胞的杀伤活性(P＜0.05).结论:成功构建了真核共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1,人B7.2/MAGE-1基因修饰的EC9706肿瘤细胞瘤苗,可诱导出明显的抗EC9706细胞的免疫效应.     

重组腺病毒载体mIL-12治疗小鼠黑色素瘤的实验研究

目的： 观察重组腺病毒载体AdmIL-12对小鼠黑色素瘤的治疗效应.方法： 皮下注射B16黑色素瘤细胞给C57BL/6小鼠建立荷瘤模型.于瘤内注射重组腺病毒载体AdmIL-12治疗, 观察皮下肿瘤的生长及荷瘤小鼠的存活期.采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测荷瘤小鼠脾细胞的杀伤活性.结果： 重组腺病毒载体AdmIL-12治疗后, 能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长, 明显延长荷瘤小鼠的存活时间, 增强荷瘤小鼠脾细胞的杀伤活性.结论： 重组腺病毒载体AdmIL-12对小鼠黑色素瘤有显著的治疗效应.     

酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用

目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)是新型自杀基因,利用重组逆转录病毒载体(RV),将YCD高效导入人原代T细胞,并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应。方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR,瞬时质粒共转染法制备RV,流动感染法或Retronectin 离心法感染人原代T细胞,嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR,检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能,在体外和SCID小鼠体内,探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等。结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106TU/mL。流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%,2轮离心 Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n=3)。经嘌呤霉素筛选48h获得T-YCD-puroR细胞,其基因阳性率96.7%±1.5%,并可大量扩增。与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义。体外实验显示,与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071mg/Lvs22.3mg/L),对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0μmoL/Lvs4.9μmoL/L)。T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠,7d后每只小鼠腹腔注射5μmoL的5-FC,连续7d,首次给药24h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45 细胞显著下降(P<0.01)。结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响,T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤。本研究为进一步研究打下了良好的基础。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响

背景：以往促进骨髓间充质干细胞软骨分化的研究,多将胰岛素样生长因子1作为辅助因子与其他细胞因子联合应用,而胰岛素样生长因子1单独应用能否促进骨髓间充质干细胞分泌软骨特异性胶原仍存在争议,其对骨髓间充质干细胞软骨分化及软骨胶原纤维稳定性的影响尚不清楚。 目的：观察胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化以及基质金属蛋白酶表达的影响。 方法：构建含有胰岛素样生长因子1基因完整编码区的表达载体,稳定转染至大鼠骨髓间充质干细胞,设为胰岛素样生长因子1稳定转染组,同时设未转染组作对照。 结果与结论：MTT检测结果显示,实验成功筛选得到胰岛素样生长因子1稳定过表达的骨髓间充质干细胞,转染后4 d,细胞增殖能力显著增强(P < 0.05)。RT-PCR,Western blot法及免疫细胞化学检测结果显示,与未转染组相比,胰岛素样生长因子1稳定转染组细胞胰岛素样生长因子1,Ⅱ型胶原 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P < 0.01),基质金属蛋白酶1,2,3 mRNA表达显著降低(P < 0.01)。结果证实,单独应用胰岛素样生长因子1能够有效促进骨髓间充质干细胞的增殖以及软骨分化,并维持软骨胶原纤维的稳定性。