孕期雌鼠摄入超量咖啡因对胎鼠软骨内骨化的影响及其机制

目的 探讨孕期雌鼠摄入超量咖啡因对胎鼠软骨内骨化的影响及其分子机制.方法 在孕第9～20天,咖啡因暴露组Wistar孕鼠每天灌胃120 mg/kg咖啡因,对照组灌胃相同体积的蒸馏水.将孕20 d的孕鼠脱颈处死,取出胎鼠,测量两组胎鼠体长;分离胎鼠股骨远端,测量股骨远端软骨长度,并制备原代软骨细胞,分别用咖啡因(0.1、...     

一种实用的基因组DNA提取方法及其应用

一种实用的基因组ＤＮＡ提取方法及其应用林长坤姜莉张励金春莲孙开来（基础医学院医学遗传学教研室，沈阳１１０００１）关键词氯化钠饱和溶液；基因组ＤＮＡ；多聚酶链式反应；杜氏肌营养不良随着聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的创建，已建立多种方法来制备ＰＣＲ模板ＤＮ...     

面肩肱型肌营养不良实时荧光定量PCR诊断方法的影响因素分析

目的分析探讨面肩肱型肌营养不良（FSHD）实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）诊断方法的影响因素。方法通过改变镁离子终浓度、PCR扩增中退火温度、退火时间或延伸时间、RNaseH酶用量和活性等,确定FQ-PCR诊断FSHD的最佳反应条件。结果退火温度55℃、时间20s、镁离子终浓度5．OmM、RNaseH酶用量IOOU、RNaseH酶在95℃下灭活8min为最佳反应条件,其中RNaseH的活性选择对FSHD诊断的特异性影响较大。结论通过降低RNaseH酶的活性可提高诊断的特异性,最终确立了FSHD的FQ-PCR基因诊断最佳反应条件。     

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B～D方法并验证其准确性。方法比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列，设计特异的组合引物探针，应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患血清标本进行基因型B、C、D检测，并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果128例标本中B型检出率为20.3％(26／128)，C型71．9％(92／128)，D型7．8％(10／128)：18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型，适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。     

产ESBLs大肠埃希菌磺胺耐药基因sulⅠ的检测与分析

产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum b-eta-lactamases,ESBLs)是由质粒介导的能赋予细菌水解青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类抗生素的一类β-内酰胺酶,其水解活性能被β-内酰胺酶抑制剂所抑制.大肠埃希菌是医院感染常见的病原菌,而产ESBLs大肠埃希菌在临床分离率逐年升高,其对β-内酰胺酶类、氨基糖苷类和磺胺类等常用抗菌药物表现出多重耐药.在对肠杆     

HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用。 方法 采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） 法扩增目的基因HIF-1α 并亚克隆到含有报告基因EGFP 的pShuttle-CMV-EGFP 穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒。将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno 骨架载体上,获得pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒质粒,继而在H293 细胞中扩增,纯化后进行PCR 鉴定并测定病毒滴度。 结果 pShuttle-EGFPHIF-1 α 经KpnI/BamHI 双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb 和5.1 kb 处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1 kb 处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒与pAdeno 载体重组后,经XhoI 单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb 八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb 六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α 腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒成功包装纯化后经PCR 鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb 片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1α 基因;TCID50 法测定纯化后的病毒滴度为2×10 10 PUF/ml 。 结论 成功构建了HIF-1α 和EGFP 双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础。     

胃癌患者外周血缺氧诱导因子-1α的表达及其意义

目的：检测胃癌患者外周血缺氧诱导因子-1α（ HIF-1α） mRNA的表达情况,探讨其临床意义。方法采用荧光定量RT-PCR技术检测50例胃癌患者及30例健康对照者外周血中HIF-1αmRNA表达情况。结果胃癌患者HIF-1αmRNA表达阳性率为54．0％（27/50）,高于对照组的0％（0/30）,两组比较差异有统计学意义（P＜0．01）;T3～T4期胃癌患者HIF-1αmRNA阳性表达率为64．7％（22/34）,高于T1～T2期患者的31．3％（5/16）,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论胃癌患者外周血HIF-1αmRNA的表达可作为检测肿瘤细胞转移的分子标志物之一,有助于预后的判断。     

反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。     

实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立

目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTRECs）水平的方法。推测其中的初始T细胞的数目,评价胸腺功能,从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段,构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后,实时定量PCR反应建立标准曲线,并检测不同品系（BALB／c和C57BL／6）成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后,在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明,这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法。为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。     

25-羟维生素D3水平与2型糖尿病肾病的相关性研究

目的：观察2型糖尿病肾病(T2DN)患者血浆维生素D和肾功能生化指标变化情况,评价维生素D在T2DN发生发展中的意义。方法：对72例T2DN患者按24 h尿白蛋白定量(24 h-UAE)分为正常蛋白尿组( A组)、微量蛋白尿组( B组)和大量蛋白尿组(C组),同时选择相匹配的22名健康人作为对照组(D组)。检测4组血浆尿素(UREA)、血肌酐(Cr)、尿酸(UA)、24 h-UAE及血清25-羟维生素D3[25-(OH)D3]水平。并分析血清25-(OH)D3与肾功能指标的相关性。结果：A、B和C 3组血清25-(OH)D3水平均较D组明显降低(P<0.01),C组患者亦均较A组和B组患者明显降低(P<0.01),A组和B组差异无统计学意义(P>0.05)。 C组患者血浆UREA、Cr和24 h-UAE较A、B、D组患者明显升高(P<0.01),B组和A组患者差异均无统计学意义(P>0.05)。 A、B、C 3组T2DN患者和D组血浆UA水平差异均无统计学意义(P>0.05)。25-(OH) D3与UREA、Cr和24 h-UAE均呈负相关关系(P<0.05),与UA无相关关系(P>0.05)。结论：合并25-(OH)D3缺乏的T2DN患者可能更容易出现肾脏病变。