雌激素对人肠系膜平滑肌细胞钙激活钾通道的作用

目的 研究雌激素对人肠系膜平滑肌细胞钙激活钾通道电流的影响.方法 用急性酶分离法分离人肠系膜平滑肌细胞,采用单通道膜片钳技术记录该细胞上的钙激活钾通道电流.结果 雌激素浓度依赖性的不可逆性的激活人肠系膜平滑肌细胞钙激活钾通道.在细胞贴附式膜片(cell-attached patch)下,膜电位为 50 mV时,10、70、150、200、300 μL/mL的雌激素,可使通道开放概率从0.0214±0.0112分别增加到0.0385±0.0146(n=8,P＜0.05)、0.0425±0.0251(n=8,P＜0.01)、0.0614±0.0152(n=8,P＜0.01)、0.1263±0.0346(n=8,P＜0.01)、0.2636±0.1046(n=8,P＜0.01).在内面向外式膜片(inside-out patch)下,膜电位为 50 mV时,10、70、150、200、300 μL/mL的雌激素,可使通道开放概率从0.0342±0.01024分别增加到0.0454±0.0231(n=8,P＜0.01)、0.0617±0.0137(n=8,P＜0.01)、0.0980±0.0202(n=8,P＜0.01)、0.1203±0.0153(n=8,P＜0.01)、0.3149±0.0851(n=8,P＜0.01).随着雌激素浓度的增加,通道活动逐步被激活,这种作用冲洗后不可逆.结论 雌激素对人肠系膜平滑肌细胞钙激活钾通道电流有一定激活作用,提示雌激素对人肠系膜阻力血管有一定的舒张作用.     

马桑内酯对大鼠海马神经元钠电流的影响

目的 研究马桑内酯(coriaria lactone,CL)对大鼠海马神经元钠离子通道电流的影响,探讨该影响在CL致痫中的意义.方法 利用全细胞膜片钳技术,在急性分离的大鼠海马神经元上记录钠电流,观察CL对电流幅度的影响.结果 经0.1 mg/mL、0.2 mg/mL的CL作用后,海马神经元钠电流有不同程度的增加[CL 0.1 mg/mL组的最大峰值电流密度为(-90.11±14.02) pA/pF,增幅为17.32%±8.52%;CL 0.2 mg/mL组的最大峰值电流密度为(-111.52±6.65) pA/pF,增幅为37.98%±4.91%];经与对照组相比,CL 0.2 mg/mL组(P＜0.05)的变化较CL 0.1 mg/mL组(P＞0.05)明显.结论 CL使海马神经元电压依赖性钠电流的幅度增大,从而改变细胞的兴奋性,引发异常放电.     

β淀粉样肽25-35对原代培养的海马神经元电压门控钙通道电流的影响

目的 探讨β淀粉样肽25-35(Aβ25-35)对海马神经元电压门控的钙通道电流(VGCC)的作用.方法 应用全细胞膜片钳技术记录海马神经元上的VGCC,通过设定不同的钳制电压分别记录高电压激活的钙电流(HVA-ICa)和低电压激活的钙电流(LVA-ICa),并观察Aβ25-35对其的影响.结果 分别对原代培养的海马神经元急性胞外给予2μmol/L和10 μmol/L的凝聚态Aβ25-35,在最大激活电压下加药后ICa幅度分别是加药前的99.80%±0.02%及100.00%±1.58%,差异没有统计学意义.10 μmol/L凝聚态Aβ25-35预孵育24 h可增大ICa,对照组(未给Aβ25-35)为(24.49±4.35)pA/pF,Aβ25-35组(预孵育24 h)为(46.59±7.15)pA/pF,两组差异有统计学意义(P＜0.05);但Aβ25-35组的膜电容[(14.34±1.74)pF]与对照组[(14.44±0.97)pF]相比差异没有统计学意义.结论 急性给予凝聚态Aβ25-35对VGCC没有影响,24 h预孵育凝聚态Aβ25-35增大了VGCC,而膜电容没有改变,提示凝聚态Aβ25-35可通过对细胞膜上钙通道进行分子调控以增大VGCC.     

兔急性心肌梗死后梗死周边带心肌细胞L-型钙通道的变化

探讨L型钙通道在急性心肌梗死 (AMI)后室性心律失常发生中的作用及其机制。方法 :以开胸冠状动脉结扎法制备兔AMI模型 ,1周后处死动物分离心室肌细胞 ,采用全细胞膜片钳记录技术观察梗死周边缺血带心外膜心室肌细胞L型钙通道电流 (ICa L)的变化 ,以正常心肌ICa L为对照。结果 :AMI 1周时兔梗死周边区心室肌细胞L型钙电流受到抑制 ,其电流峰值由正常状态下的 - 5 .58± 1 .53pA/pF(对照组 ,n =1 0 )降至 - 3 .52± 0 .93pA/pF(AMI组 ,n=6) ,最大峰电流下降 2 9.1 % ,P <0 .0 5 ,I V曲线上移 ;其失活曲线左移 ,半数最大失活电位由 - 1 3 .1± 4 .2mV左移至 - 2 5 .9± 7.0mV ,P <0 .0 5 ,失活速度加快。结论 :AMI后 1周梗死周边带心外膜心室肌细胞L型钙通道受抑制 ,可能为AMI后室性心律失常发生的机制之一。     

乳兔窦房结细胞的分离及鉴定

目的 乳兔窦房结细胞（sinus node cell,SNC）的分离、纯化、培养与鉴定.方法 选用新生新西兰乳兔5只,采用双酶解法对细胞进行消化分离,差速贴壁结合5-BrdU对分离的细胞进行纯化培养,观察SNC形态变化并采用全细胞膜片钳技术对SNC进行动作电位的记录.结果 培养得到的SNC主要有3种形态：梭形、三角形与不规则形,而梭形细胞最多,搏动频率最快,符合窦房结细胞的特征.采用膜片钳技术记录10个梭形细胞的动作电位中,平均最大舒张电位为（-50.9±5.3）mV,动作电位幅度为（61.9±4.8）mV.结论 采用双酶解、差速贴壁及BrdU对乳兔窦房结细胞进行消化、分离可得到纯化的SNC,此种方法得到的SNC状态活性良好,且具有典型特征的动作电位.     

钾离子通道β亚单位KCNE4对KCNQ1及HERG电流的影响

目的:研究钾离子通道β亚单位KCNE4对KCNQ1及HERG通道电流的影响。方法: 构建离子通道细胞模型,单独表达基因KCNQ1、HERG,以及联合表达基因KCNQ1+KCNE4、HERG+KCNE4。采用全细胞膜片钳方法记录通道电流曲线,比较组间电流的大小及通道的动力学特征。采用免疫荧光细胞定位方法,检测KCNE4对通道蛋白表达的影响。结果: KCNE4与 KCNQ1共表达显著减低KCNQ1通道电流。单独表达KCNQ1通道的细胞,膜电位+60 mV时,平均电流密度为(24±2.9) pA/pF,共表达KCNQ1+KCNE4时,细胞电流密度降至(7.3±1.1) pA/pF。与KCNQ1电流相比,+40 mV时KCNQ1/KCNE4激活时间常数的快成分(τfast)增加,但慢成分(τslow)减慢,KCNQ1/KCNE4无尾电流产生,表明KCNE4参与了KCNQ1通道动力学的调整。单独表达KCNE4亚单位的细胞没有产生任何电流。当KCNE4与HERG共表达时,电流的大小、电流电压关系曲线及通道稳态激活曲线都与HERG通道无明显差异,电流密度为(26.7±3.9) pA/pF,半数激活电压(V1/2)为(-3.10±0.68) mV,斜率因子为8.89±0.33。从通道的失活时间常数以及失活后恢复时间常数与测试电压的关系曲线可见,KCNE4对HERG通道的动力学特征均无影响。免疫荧光染色结果显示,KCNE4没有影响KCNQ1蛋白的表达。结论: KCNE4亚单位可显著改变KCNQ1通道的电压敏感性,表现出抑制作用,KCNE4对KCNQ1蛋白在细胞膜上的表达及HERG通道电流均无影响。     

二十二碳六烯酸及其代谢产物对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的激活作用

目的研究二十二碳六烯酸（DHA）及其代谢产物16,17-环氧二十二碳五烯酸（16,17-EpDPE）对正常大鼠冠状动脉平渭肌细胞大电导钙激活钾通道（BK）单通道的激活作用,探讨DHA扩张冠状动脉、保护心血管的机制。方法酶消化法分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞,采用膜内向外型单通道膜片钳实验技术记录0,0．01,0．1,0．3,1,3,5,7．5和10mmol／L浓度下DHA及其代谢产物16,17-EpDPE灌流后BK单通道开放概率。结果在电极外液钙离子浓度为1mmol／L和刺激电位60mV条件下,DHA浓度为0,0．01,0．1,0．3和1mmol／L时,BK通道开放概率分别为0．0914±0．0098,0．0907±0．0102,0．0945±0．0091,0．0986±0．0112和0．1104±0．0145（P〉0．05,n=5）;DHA浓度为3,5,7．5和10mmol／L时,BK单通道开放概率分别为0．6712±0．0456,0．7511±0．0798,0．8424±0．1373和0．8669±0．0967（P〈0．05,n=5）,呈浓度依赖性增高。16,17-EpDPE浓度为0,10,50和100nmol／L时,BK单通道开放概率分别为0．1025±0．0114,0．1006±0．0091,0．1128±0．0132和0．1081±0．0143（P〉0．05,n=5）。结论低浓度DHA不能激活BK单通道,高浓度DHA可能通过与BK通道结合并直接激活BK单通道,这可能是DHA扩张冠状动脉的机制之一。     

国人冠心病发生VT/VF的首个致病基因SCN5A的发现及突变功能分析

目的心源性猝死(SCD)高危患者常见于两大类人群,一类为心脏结构正常的患者,另一类为心脏结构异常的患者。心脏结构异常患者发生SCD以冠心病患者多见,国际上曾报道SCN5A基因突变与心梗后电风暴有关。本研究将对国人冠心病并发恶性室性心律失常患者进行SCN5A基因筛查,以探索是否SCN5A与国人缺血性心律失常相关,并揭示其细胞电生理致病机制。方法临床收集冠心病发生恶性心律失常患DNA标本31份,使用DNA直接测序技术对选基因SCN5A进行筛查,寻找基因突变,使用细胞膜片钳技术进行突变通道功能分析。结果本研究对31例国人冠心病发生VT/VF患者进行已知致病基因SCN5A筛查,发现2个SCN5A基因新突变,即L1469S和R812C突变。通过细胞膜片钳技术,分别对转染R812C突变和L1469S突变的HEK293细胞进行功能分析,观察峰值电流,I-V曲线,电流密度,电流失活等特性。结果与正常对照组相比,发现突变通道明显增加SCN5A峰值电流密度,I-V曲线电流失活没有明显差异。结论首次揭示SCN5A基因是国人冠心病发生恶性心律失常的致病基因,其突变通道功能获得是发生冠心病发生恶性心律失常的细胞电生理机制。     

无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型电压门控性钠通道Na_v1.1和钙调蛋白的异常表达

目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测电压门控性钠通道Nav1.1和钙调蛋白的表达与定位。方法采用新生24h内Wistar大鼠,取海马进行神经元原代培养。体外培养至10d,无镁细胞外液处理(实验组)或正常细胞外液(对照组)处理神经元3h后,一部分细胞应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况并应用免疫印迹法检测电压门控性钠通道Nav1.1和钙调蛋白的蛋白表达;另一部分细胞用正常培养液继续培养12h后分别通过免疫印迹法和免疫荧光双标法检测Nav1.1和钙调蛋白的蛋白表达与共定位。结果无镁细胞外液处理3h后的神经元存在自发的"癫痫样"放电,而与正常细胞外液处理组相比,Nav1.1和钙调蛋白表达不变;无镁处理3h正常培养液再继续培养12h后,与正常细胞外液处理组相比,神经元Nav1.1表达上调,而钙调蛋白表达不变。另外,与正常细胞外液处理组相比,Nav1.1和钙调蛋白共定位的阳性细胞数增加。结论 Nav1.1和钙调蛋白的表达与定位变化可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关。     

物理因子对神经系统影响的研究现状和膜片钳技术的应用

人们生活的环境中物理因子的影响无处不在。物理因子对人神经系统的影响也是十分的突出。目前这方面的研究也很多，但是方法各不相同并且只是在生物整体或器官水平上的。膜片钳技术是一种先进的电生理技术，通过该技术研究物理因子对神经系统的影响，可以在细胞和分子水平上揭示物理因子作用下神经系统的某些重要的生理功能。文中回顾了国内外物理因子对神经系统的研究方法和现状，简要介绍神经系统结构和功能以及膜片钳的基本原理．提出了膜片钳技术在研究物理因子对神经系统影响中的可能应用与前景。