小鼠H2B-GFP真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体,为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化,进一步研究小鼠耐药细胞中双微体（DMs）的形成机制提供有效的分子工具。方法 利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA,以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体上,构建H2B-GFP真核表达载体,经菌液PCR、酶切及DNA测序鉴定插入片段大小、方向及序列的正确性,提取质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3进行鉴定。结果 经菌液PCR、酶切和测序,证明小鼠H2B-GFP真核表达载体含有大小、方向及序列正确的H2B cDNA片段,转染NIH3T3后在细胞核中表达。结论 作者成功构建了同时携带有G418筛选位点及多酶切位点的小鼠H2B-GFP真核表达载体,为其在小鼠体外培养细胞中的表达奠定了基础。     

RNA干扰技术抑制鼻咽癌细胞内源性绿色荧光蛋白的表达

目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的鼻咽癌细胞株;观察不同转染浓度的短发卡状RNA对鼻咽癌细胞内源性GFP的抑制效率及细胞毒性.方法:转染pEGFP-N1至鼻咽癌细胞株HNE1,G418筛选获得稳定表达GFP的HNE1-GFP细胞株;利用针对GFP基因的短发卡状RNA表达载体shGFP,以不同浓度shGFP转染HNE1-GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,软件分析荧光抑制效率,MTT检测细胞毒性,RT-PCR检测GFPmRNA水平改变,Western Blot检测GFP蛋白水平改变.结果:绿色荧光稳定表达于传代HNE1细胞中;shGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达,抑制效率分别为49.7%,84.8%,86.7%且无细胞毒性;GFP在mRNA和蛋白水平的表达均有明显下降.结论:稳定表达GFP的鼻咽癌细胞株成功建立;RNA干扰载体可抑制鼻咽癌细胞中GFP的表达,其抑制效率有明显的浓度依赖性且无明显细胞毒性.该系统能够用于鼻咽肿瘤的RNA干扰机制研究中.     

HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.     

针刺董氏奇穴联合超短波治疗颞下颌关节功能紊乱综合征的疗效观察

目的:观察针刺董氏奇穴联合超短波治疗颞下颌关节功能紊乱综合征的疗效,为其临床应用提供依据。方法:将120例患者随机均分为董氏奇穴组、超短波组和联合组各40例,分别予以针刺董氏奇穴、超短波治疗、针刺董氏奇穴联合超短波治疗。结果:治疗3周后,3组患者开口度均较治疗前明显提高(均P<0.05),且董氏奇穴组和联合组均明显高于超短波组(均P<0.05),联合组明显高于董氏奇穴组(P<0.05);3组VAS评分均较治疗前明显下降(均P<0.05),且董氏奇穴组和联合组均明显低于超短波组(均P<0.05),联合组明显低于董氏奇穴组(P<0.05);3组总有效率比较,联合组高于董氏奇穴组和超短波组(P<0.05),董氏奇穴组高于超短波组(P<0.05)。结论:针刺董氏奇穴联合超短波治疗颞下颌关节功能紊乱综合征能有效改善颞下颌关节功能状况,缓解疼痛。     

两种方法转染EGFP基因对脐血造血干/祖细胞体外生长影响的比较

目的 探讨两种非病毒载体介导增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染方式对脐血干/祖细胞体外生长的影响.方法 免疫磁珠分选CD34 脐血干/祖细胞,平均分为3组,即未转染EGFP组、阳离子聚合物转染EGFP组和电穿孔转染EGFP组,将各组脐血CD34 细胞接种于人骨髓间充质干细胞(MSCs)构建的二维培养体系中在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,7 d后进行集落形成单位(CFU)实验和高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)实验.并利用荧光显微镜观察转染EGFP的CD34 细胞集落形成,Wright-Giemsa 染色了解其分化情况.结果 阳离子聚合物转染和电穿孔转染都可减少造血干/祖细胞集落形成的数目,且集落的大小也较未转染组小(P＜0.05).电穿孔转染组荧光集落形成的数目多于阳离子聚合物转染组,且所形成的荧光集落更大更亮(P＜0.05).两种转染方式的脐血造血干/祖细胞在体外培养后仍具有多向分化能力.结论 这两种非病毒载体介导EGFP基因转染方式均可造成脐血造血干/祖细胞生物学特性不同程度的损害.但电穿孔转染方式对于造血干/祖细胞体外生长损害较阳离子聚合物转染要小,且转染效率更高,转染基因表达更稳定.     

大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核浅层内GABA样、L-ENK样、GlyT2样阳性末梢与Sindibis病毒转染表达GFP神经元之间的联系

应用GFP基因重组病毒标记技术和免疫荧光组织化学技术,在荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜下观察了大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)浅层内GABA样、L-ENK样、GlyT2样阳性纤维和末梢与Sindibis病毒转染表达GFP神经元之间的联系.结果显示:①将GFP基因重组Sindibis病毒注入一侧Vc浅层后,仅在同侧vc注射部位附近的Ⅰ～Ⅲ层内观察到4～8个逆标的GFP神经元,这些神经元的胞体为小型(直径≤15 μm)圆形、梭形或不规则形;②Vc浅层内均可见大量的GABA样、L-ENK样、GlyT2样阳性纤维和末梢,以Ⅰ和Ⅱ层分布最为密集;③GABA样、L-ENK样、GlyT2样阳性纤维和末梢分别聚集于GFP标记神经元的胞体或树突周围,并与之形成密切接触.以上结果表明:Vc浅层内GFP神经元可能与GABA能、L-ENK能、Gly能阳性纤维和末梢形成突触联系并接受这些抑制性神经末梢的调控.     

携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

穿膜肽-EGFP融合蛋白的表达、纯化与鉴定

目的 构建EGFP-CPPs融合基因载体,表达、纯化并鉴定EGFP-CPPs融合蛋白。方法 通过碱基合成的方法合成含有CPPs基因序列的EGFP上游引物,PCR扩增后收集CPPs-EGFP融合基因片段并电泳鉴定,将融合基因表达载体转染大肠杆菌并扩增表达,收集表达蛋白后过层析柱纯化,蛋白电泳检测表达蛋白分子量,蛋白飞行质谱分析检测蛋白序列,体外细胞实验验证其穿膜功能。结果 电泳检测可见与CPPs-EGFP分子量对应的电泳条带,构建质粒测序含有目的基因序列。蛋白电泳检测到纯度较高的融合蛋白,其蛋白序列与目的序列一致。体外细胞实验证实了融合蛋白的穿膜功能。结论 成功制备了具有穿膜功能的CPPs-EGFP融合蛋白,为其促进抗体-蛋白微球偶联物进入肿瘤细胞发挥治疗作用的研究奠定了基础。     

β2M-绿色荧光蛋白在MHC-Ⅰ肽亲和力实验中的应用

目的 构建并表达β2微球蛋白-绿色荧光蛋白融合蛋白,并应用该蛋白建立一种全新的MHC-Ⅰ肽亲和力实验方法.方法 构建β2M-ZsGreen-6×His标签的融合蛋白真核表达质粒,转染293FT细胞表达,并以镍亲和层析法纯化,将该融合蛋白与表位肽共同与,12细胞反应,通过流式细胞术检测T2细胞标记绿色荧光的情况鉴定表位.结果 构建了B2微球蛋白-绿色荧光蛋白真核表达质粒并表达、纯化得到融合蛋白,该蛋白可应用于亲和力实验,进行表位鉴定.结论 β2微球蛋白-绿色荧光融合蛋白应用于亲和力实验鉴定CTL表位方法可行,步骤简便,适用于大通量表位鉴定.     

重组9型腺相关病毒载体转染小鼠心脏及对心功能的影响

目的 探讨重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated serotype 9,rAAV9)载体对小鼠心脏的转染效果及对心功能的影响.方法 16只昆明种小鼠经尾静脉将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-eGFP)转染入小鼠,于7、14、21、28 d留取标本,使用荧光显微镜观察eGFP在心肌、肝、肺、肾、脑、骨骼肌的荧光表达,Western blot法检测eGFP)的蛋白表达.另20只昆明种小鼠随机分为2组,每组10只,分别经尾静脉注射rAAV9-eGFP)和生理盐水,28 d后行心脏超声及血流动力学检查.结果 rAAV9-eGFP经尾静脉注射21 d时eGFP表达在心脏达到高峰,转染效率可达32%,在其他脏器表达量少或无表达.rAAV9-eGFP组较生理盐水组心功能差异无统计学意义(P＞0.05).结论 rAAV9可通过外周静脉注射在心脏较高表达,且对心功能无不良影响.