叶酸-蒜酶缀合物的合成及联合蒜氨酸原位抑制肿瘤细胞增殖作用

合成叶酸-蒜酶缀合物(FA-Alliinase),采用宫颈癌HeLa细胞考察其对肿瘤细胞的靶向性和抑制肿瘤生长活性。采用两种方法合成叶酸-蒜酶缀合物FA-AlliinaseⅠ和FA-AlliinaseⅡ,测得两种缀合物的偶联比分别为12和31,选择高偶联比的FA-AlliinaseⅡ,对其结构进行初步的表征。高效液相色谱法测得FA-AlliinaseⅡ有约50%的蒜酶活力;激光共聚焦及流式细胞仪观察到FA-AlliinaseⅡ对HeLa细胞具有一定的靶向性,MTT法测得FA-AlliinaseⅡ联合蒜氨酸后对HeLa细胞增殖有抑制作用,以蒜氨酸计IC₅₀为(127.6±2.3)μmol/L。该研究为类前药叶酸-蒜酶缀合物的合成优化提供了较为直接的评价方法。     

化痰通络汤治疗痰瘀阻络型急性脑梗死

目的:观察化痰通络汤治疗急性脑梗死痰瘀阻络证患者的临床疗效。方法:100例急性脑梗死患者按照随机数字表法分为对照组和观察组,每组各50例。对照组在常规治疗基础上给予丹参注射液,观察组患者在常规治疗基础上给予化痰通络汤。治疗后,比较两组患者临床疗效、中医证候积分、血液流变学、炎症因子、同型半胱胺酸及神经元特异性烯醇化酶水平。结果:观察组有效率为98%(49/50),对照组有效率为84%(42/50),两组有效率比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。两组患者治疗后中医证候积分与治疗前比较,差异均有统计学意义(P 0. 01或P 0. 05);观察组治疗后中医证候积分显著低于对照组治疗后(P 0. 01或P 0. 05)。两组患者治疗后全血黏度、血浆黏度、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)、三酰甘油、胆固醇水平均低于治疗前,差异均有统计学意义(P 0. 05);观察组治疗后三酰甘油、胆固醇均低于对照组治疗后,差异均有统计学意义(P 0. 05)。两组患者治疗后超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6水平均低于治疗前,差异均有统计学意义(P 0. 05);观察组治疗后以上指标均显著低于对照组,差异均有统计学意义(P 0. 05)。两组患者治疗后同型半胱胺酸、神经元特异性烯醇化酶均低于治疗前,差异均有统计学意义(P 0. 05);观察组治疗后以上指标均显著低于对照组,差异均有统计学意义(P 0. 05)。结论:化痰通络汤可以通过改善急性脑梗死患者血液流变学指标和神经功能缺损,减少炎症反应,降低血栓形成危险因子的水平,提高急性脑梗死的临床疗效。     

肠愈宁颗粒对大鼠溃疡性结肠炎的药效及作用机制

目的:探讨肠愈宁颗粒对二硝基氯苯乙酸复合法诱导的大鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的药效作用及机制。方法:将SD大鼠随机分成6组,正常对照组、模型组、肠愈宁颗粒低、中、高剂量组以及柳氮磺胺吡啶组。除正常对照组外,其他组大鼠采用二硝基氯苯乙酸复合法造模。截取结肠做HE染色并对组织损伤进行评价;ELISA方法检测大鼠血清中白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达水平,并通过免疫印迹法检测结肠组织中过氧化物酶增殖物激活受体-γ(eroxisome proliferators-activate receptor Gamma,PPAR-γ)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的蛋白表达。结果:与正常对照组相比,模型组大鼠体质量明显减轻,疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分增高,同时大鼠血清中IL-6和IL-8水平明显升高,结肠组织PPAR-γ的表达降低、NF-κB的表达升高。与模型组比较,肠愈宁颗粒各剂量组大鼠上述指标明显改善,尤其肠愈宁颗粒高剂量组大鼠的疗效接近于阳性对照组。结论:肠愈宁颗粒能有效减轻大鼠实验性溃疡性结肠炎,缓解炎症反应,其机制可能是调节PPAR-γ/NF-κB信号通路从而减少炎症因子释放。     

续断对SCI大鼠MPO活性和脊髓空腔面积的影响

目的:研究续断对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后大鼠脊髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性和脊髓组织空腔面积的影响。方法:SD大鼠40只,均采用Allen法制作脊髓损伤模型,随机分为对照组和实验组,实验组采用续断水煎剂进行灌胃,对照组采用等量的PBS进行灌胃,2周后取材,进行MPO活性检测和脊髓组织切片HE染色并计算空洞面积。结果:2周后对照组和实验组大鼠MPO活性分别为(33.43±4.82) U·mg~(-1)和(7.55±1.76)U·mg~(-1),对照组和实验组脊髓空洞面积分别为(0.09±0.03)mm~2和(0.19±0.05)mm~2,两组比较,差异有统计学意义(P0.01)。结论:大鼠脊髓损伤后,续断可以有效减少局部炎性细胞的聚集,抑制炎性反应,减少脊髓组织受到继发性损害。     

甲状腺结节微波消融治疗后6个月消融区细胞活性的酶组织化学检测

目的 探讨甲状腺结节微波消融治疗术后6个月消融区组织内细胞活性情况。方法 选择2017年12月至2018年9月甲状腺结节微波消融治疗术后6个月进行消融区粗针穿刺活组织检查病理评估的患者20例24个消融区。使用切割式活检针分别对消融区中央域及边缘域进行粗针穿刺活组织检查,取得标本条置入液氮制成冰冻切片。采用酶组织化学染色法检测细胞内琥珀酸脱氢酶（SDH）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶（NADPH-d）的活性,并与常规病理切片H-E染色观察到的细胞形态及组织结构对比。结果 微波消融术后6个月24个消融区的中央域及边缘域均成功取材。消融区中央域SDH及NADPH-d酶组织化学染色情况一致性好,阴性率均为95.83%（23/24）。消融区边缘域SDH及NADPH-d酶组织化学染色情况一致性好,阴性率均为91.67%（22/24）。23个中央域及22个边缘域的H-E染色切片均显示为红染无结构的大片坏死组织;1个中央域、2个边缘域H-E染色切片显示部分为坏死结构、部分为纤维组织增生,纤维组织增生处与酶组织化学染色阳性区域位置一致。结论 微波消融术后6个月甲状腺结节消融区组织符合凝固性坏死改变,仍处于失活状态,酶组织化学染色结合H-E染色能够对陈旧消融区做出较为客观的评价。     

III期结直肠癌中NLRC3与预后和肿瘤免疫的关系

目的：探讨核苷酸寡聚化结构域样受体家族半胱天冬酶募集结构域蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family caspase recruitment domain containing 3,NLRC3)与III期结直肠癌的预后及肿瘤免疫相关指标 的关系。方法：回顾性收集中南大学湘雅医院2012年至2013年122例经手术根治切除的III期结直肠癌患者的相关资 料。利用免疫组织化学法分析NLRC3与CD8+ T细胞的表达情况,利用患者的术前临床资料计算中性粒细胞/淋巴细 胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio,NLR),并检测其微卫星稳定性。采用χ2检验分析NLRC3与临床病理因素之间的 关系,采用COX回归模型分析III期结直肠癌的独立预后因素。结果：在III期结直肠癌中,肿瘤组织CD8+ T细胞浸润 分期(χ2=27.79,P<0.01)、NLR值(χ2=6.35,P<0.05)、淋巴结转移分期(χ2=10.12,P<0.01)以及微卫星稳定性(χ2=6.05, P<0.05)与NLRC3的表达有关。NLRC3(OR=0.066,95% CI：0.020~0.218)、血管癌栓(OR=3.119,95% CI：1.547~6.286) 及NLR(OR=5.103,95% CI：2.465~10.563)对III期结直肠癌的5年总生存期(overall survival,OS)有影响(均P<0.05);另 外,NLRC3(OR=0.144,95% CI：0.055-0.377)、血管癌栓(OR=3.589,95% CI：1.859~6.932)及NLR(OR=2.939,95% CI： 1.509~5.723)对III期结直肠癌的无病生存期(disease free survival,DFS)同样有影响(均P<0.05)。结论：NLRC3,血管癌栓 和NLR是III期结直肠癌的独立预后因素。NLRC3通过抑制系统性炎症、促进局部抗肿瘤免疫而使III期结直肠癌患者 具有良好的预后。     

人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定

目的：高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法：人工合成经密码子优化的NGAL基因,构建原核表达重组质粒pW28-NGAL,IPTG诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的rhNGAL抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争ELISA法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE分析纯度;最后运用Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果：高效获得高纯度NGAL重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得6株高效价单克隆抗体;其中,25号单抗为IgG1亚型,余者均属IgG2a亚型,且19、35号单抗的亲和常数分别为3.06×109、2.14×109。SDS-PAGE分析表明纯度均大于90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论：本研究利用密码子优化技术高效表达制备了NGAL重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为NGAL的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。     

糖尿病心肌病患者过氧化物酶增殖物激活受体水平变化的研究

目的 观察糖尿病心肌病（DCM）患者过氧化物酶增殖物激活受体（PPARs）水平变化,并探讨其影响DCM的可能机制。方法 选取2016年10月—2017年10月郑州大学附属南阳市中心医院住院治疗的DCM患者（DCM组）74例、单纯糖尿病患者（T2DM组）71例和同期健康体检者（NC组）70例,收集各组一般资料,采用ELISA检测PPARs水平并比较。结果 DCM组空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、甘油三酯（TG）及高敏感C反应蛋白（hs-CRP）高于T2DM组和NC组（P?<0.05）,T2DM组FPG、HbA1c及TG高于NC组（P?<0.05）;DCM组PPARα和PPARγ高于T2DM组和NC组（P?<0.05）,PPARβ/δ低于T2DM组和NC组,且T2DM组PPARα和PPARγ高于NC组,PPARβ/δ低于NC组（P?<0.05）。结论 DCM患者PPARα和PPARγ水平升高,PPARβ/δ水平降低,PPARs可能在DCM的发生、发展中起到重要作用。     

仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析

摘要： 目的 研究仪征地区 鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药相关酶表型和基因型的分布情况,探讨该 地区广泛耐药鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制。方法 根据常规药敏试验结果将鲍曼不动杆菌临床分离株分为广泛耐药组和普通组,分别选取25株和23株用改良EDTA纸片增效法检测金属β-内酰胺酶;用碳青霉烯失活法检测碳青霉烯酶;用双纸片协同试验法和三维试验法分别检测染色体和质粒介导的AmpC酶;用PCR方法检测耐药基因blaOXA-23、blaOXA-24、blaTEM 、blaAmpC、blaVIM、blaNDM-1,对部分阳性产物进行测序比对。结果 鲍曼不动杆菌广泛耐药组和普通组分别占62.5%和37.5%。广泛耐药组中金属β-内酰胺酶阳性1株、碳青霉烯酶阳性4株、染色体和质粒介导的AmpC酶阳性分别为1株和23株;普通组中均未检出上述酶表型。广泛耐药组全部检出耐药基因blaOXA-23、blaTEM 、blaAmpC,均未检出blaOXA-24、blaVIM、blaNDM-1;普通组中blaOXA-23、blaOXA-24、blaTEM 、blaAmpC分别检出4株、5株、22株、12株,未检出blaVIM、blaNDM-1。两组比较,质粒介导的AmpC酶和blaOXA-23、blaAmpC基因携带率的差别具有统计学意义（χ2分别为40.627、34.183、15.511;P=0.000）。基因测序结果发现部分菌株的序列存在碱基插入或置换的改变。结论 鲍曼不动杆菌耐药性严重,产质粒介导的AmpC酶和blaOXA-23、blaAmpC基因介导的耐药机制是仪征地区 鲍曼不动杆菌广泛耐药的主要机制 。     

氯化钴对人卵巢癌SKOV3细胞顺铂敏感性的影响

目的：观察氯化钴（CoCl₂）作用于人卵巢癌SKOV3细胞株后对SKOV3细胞顺铂敏感性的影响,并阐述其可能机制。方法：体外培养SKOV3细胞株,随机分为对照组、CoCl₂组、顺铂（DDP）组和CoCl₂联用DDP （联合）组,CoCl₂组细胞以200 μmol·L^-1 CoCl₂作用4 h后换普通细胞培养基培养20 h,DDP组细胞以含10 mg·L^-1 DDP的细胞培养基培养24 h,联合组细胞以200 μmol·L^-1 CoCl₂作用4 h后更换含10 mg·L^-1 DDP的细胞培养基继续培养20 h。MTT法检测各组细胞存活率,免疫荧光法检测各组细胞中低氧诱导因子1α（HIF-1α）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性表达强度,Rhod 2-AM荧光探针检测各组细胞线粒体钙离子（Ca²⁺）水平,免疫蛋白印迹（Western blotting）法观察凋亡相关蛋白细胞色素C （cyto C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase3）蛋白表达水平,Muse^®凋亡试剂盒检测各组细胞凋亡率。结果：与对照组比较,CoCl₂组细胞存活率无明显变化（P>0.05）,其余2组细胞存活率明显下降（P<0.05）;且联合组高于DDP组（P<0.05）。与对照组比较,CoCl₂组和联合组细胞中HIF-1α阳性表达强度明显增强（P<0.05）;DDP组和联合组细胞中iNOS阳性表达强度明显增强（P<0.05）。与对照组比较,DDP组和联合组细胞Ca²⁺水平升高（P<0.05）;且DDP组高于联合组（P<0.05）。与对照组比较,CoCl₂组细胞中cyto C、caspase3和cleaved caspase3蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,DDP组细胞中cyto C、caspase3和cleaved caspase3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;且联合组低于DDP组（P<0.05）。与对照组比较,DDP组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）;联合组细胞凋亡率较DDP组降低（P<0.05）。结论：CoCl₂可以通过抑制DDP诱导的人卵巢癌SKOV3细胞株iNOS表达增强来减少线粒体途径凋亡的发生,降低其顺铂敏感性。