缺氧预处理脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞

背景：糖尿病下肢血管病变发病率的升高,使如何通过改善下肢血管及增加新生血管生成成为关注的焦点,临床上已用人脐带间充质干细胞局部肌肉注射进行治疗,但是具体的治疗效果及机制尚不明确。 目的：探讨缺氧预处理及氯化钴培养液对脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞的影响。 方法：分离、培养脐带间充质干细胞,经不同浓度氯化钴模拟体内病理状态下的缺氧,通过ELISA检测细胞上清中碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平表达、MTT检测细胞增殖,选取最适氯化钴浓度,染色体进行氯化钴诱导前后安全性检测,用含10 µg/L血管内皮生长因子、10 µg/L的碱性成纤维细胞生长因子及体积分数10%胎牛血清的DMEM-LG/F12培养液向内皮样细胞方向诱导分化,鉴定诱导前及诱导后内皮样细胞表型CD31、假性血友病因子,通过三维血管形成模型的观察进行诱导前后脐带间充质干细血管形成能力检测。 结果与结论：分离的脐带间充质干细经流式鉴定高表达脐带间充质干细相关表面标志。经含不同浓度氯化钴的培养液处理后,细胞增殖与作用时间呈正相关。根据碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平的表达,验证得出氯化钴浓度为200 µmol/L为最适浓度。染色体检测显示氯化钴干预后的安全性可靠。诱导后CD31及假性血友病因子强阳性表达,三维血管成形观察显示脐带间充质干细诱导后可形成直径大小不等的管腔样结构,证实脐带间充质干细可诱导为内皮样细胞,且具有成血管的能力。     

葛根素对二氯化钴造成PC12细胞缺氧损伤的保护作用

目的研究葛根素对PC12细胞缺氧损伤的影响。方法使用氯化钴对PC12细胞制备缺氧损伤模型,通过测定受损细胞给药后的活力、受损细胞LDH泄漏量和受损细胞SOD活力,研究葛根素对受损细胞的保护作用。结果在5×10-4~2×10-11mg.mL-1范围内,葛根素显著地增加模型受损细胞的活力;降低细胞LDH的泄露量;并增强受损细胞的SOD活性。结论葛根素对二氯化钴造成PC12细胞缺氧损伤具有修复作用。     

尼氟灭酸对氯化钴诱导海马神经元凋亡的抑制作用

目的:探讨尼氟灭酸(NFA)对氯化钴(CoCl₂)诱导的海马神经元凋亡的抑制作用,阐明其可能的机制。方法:原代培养乳鼠海马细胞,并在倒置显微镜下观察海马细胞的形态变化。将海马神经元随机分为对照组(含1%血清培养液)、CoCl₂损伤组(含200 μmol·L^-1NFA等体积培养液)和不同浓度NFA组(在CoCl₂损伤组基础上加入20、40、80 μmol·L^-1 NFA)。MTT法检测各组海马神经元的存活率,流式细胞术分析海马神经元调亡率, ELISA法检测神经元培养液上清中相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和缺氧相关蛋白低氧诱导因子(HIF-1α)的表达水平。结果:海马神经元在培养7 d后形态规则,突触相互交织形成网络。MTT检测,与对照组比较,CoCl₂损伤组神经元存活率明显降低(P<0.01);与CoCl₂损伤组比较,20、40和80 μmol·L^-1NFA组神经元存活率升高(P<0.05或P<0.01)。流式细胞术检测,与对照组比较,CoCl₂损伤组神经元早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率升高(P<0.05或P<0.01);与CoCl₂损伤组比较,20、40和80 μmol·L^-1NFA组神经元早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率下降 (P<0.05或P<0.01)。ELISA法检测,与对照组比较,CoCl₂损伤组神经元培养液上清中HIF-1α、caspase-3 和Bax表达水平升高(P<0.01);与CoCl₂损伤组比较,20和40 μmol·L^-1 NFA组神经元培养上清中HIF-1α、caspace-3 和Bax表达水平下降,Bcl-2表达水平升高(P<0.05或P<0.01)。结论:NFA可以降低CoCl₂对海马神经元的缺氧损伤作用,其机制与抑制HIF-1α的表达、下调Bax/Bcl-2及抑制神经元凋亡有关联。     

二氯化钴所致缺氧对HepG2细胞增殖抑制和凋亡的影响

目的探讨二氯化钴（CoCl₂）所致缺氧对HepG2细胞增殖抑制和凋亡的影响以及可能机制。 方法采用CoCl₂模拟低氧环境处理细胞,Western Blotting法测定胞质蛋白Caspase-3蛋白的表达;噻唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖情况;AnnexinV-FITC/PI双标记染色,流式细胞术检测不同CoCl₂浓度作用使缺氧肿瘤细胞的凋亡情况。 结果低氧处理后胞质Caspase-3的活性增加,表达呈现浓度依赖性;细胞增殖抑制作用表现出浓度依赖性抑制作用;流式细胞仪检测结果显示,正常对照组以及50、100、200、300、500 μmol/L CoCl₂模拟低氧组的细胞生长抑制率分别为（0.42±0.21）%、（1.22±0.41）%、（7.61±0.66）%、（13.31±0.97）%、（20.41±0.78）%和（28.56±0.96）%。 结论Caspase-3在肝癌发生发展过程中扮演重要的角色,在低氧情况下对HepG2细胞生长和分化具有调控作用。CoCl₂可能通过上调Caspase-3的表达,从而对肝癌细胞发挥抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。     

缺氧预处理对脐带间充质干细胞bFGF分泌的影响

目的 探讨氯化钴(CoCl_2)模拟缺氧预处理对人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)碱性成纤维生长因子(bFGF)分泌的影响.方法 分离、培养人UC-MSCs,显微镜观察其形态学特征,并运用流式细胞仪检测其表面标志物的表达;选取P3代健康人UC-MSCs,MTT法检测不同浓度(0、50、100、150、200、250μmol/L)CoCl_2对UC-MSCs活力及增殖的影响,然后将细胞分为4组,分别采用0、50、100、150μmol/L CoCl_2处理,于24、48、72h后检测bFGF蛋白及mRNA的表达并分析各组间的差异.结果 经适当浓度(≤150μmol/L)CoCl_2处理后,UC-MSCs生长加快,平台期提前,而高浓度(>200μmol/L)CoCl_2对细胞活力有负面影响.经50、100、150μmol/L CoCl_2处理后,各组bFGF蛋白分泌水平均明显高于0μmol/L CoCl_2处理组(P<0.05),且48、72h时点均高于24h时点(P<0.05),150μnol/L CoCl_2处理组72h时点bFGF蛋白表达水平明显低于48h(P<0.05),100μmaol/L CoCl_2处理组72h时点bFGF蛋白表达水平明显高于48h(P<0.05),而50μmol/LCoCl_2处理组72h时点与48h时点比较无显著差异.bFGFmRNA表达改变与蛋白基本相一致,但50μmol/L CoCl_2处理组在各时点没有显著差异.结论 适当浓度(≤150μmol/L)的CoCl_2对UC-MSCs增殖能力影响较小,可用于细胞模拟缺氧;缺氧预处理对人UC-MSCs的bFGF分泌有一定促进作用.     

热休克蛋白90在硫化氢抗化学性缺氧诱导心肌细胞氧化应激损伤中的作用

目的： 探讨热休克蛋白90（HSP90）在硫化氢（H2S）对抗化学性低氧模拟剂氯化钴（CoCl2）诱导H9c2心肌细胞氧化应激损伤中的作用。方法： 应用CoCl2处理H9c2心肌细胞,建立化学性缺氧损伤心肌细胞的实验模型。在CoCl2处理H9c2心肌细胞前30 min,把硫氢化钠（NaHS,H2S的供体）加入培养基中,作为预处理。应用高效液相色谱法（HPLC）检测细胞内ATP的含量;罗丹明123（Rh123）染色荧光显微镜照相检测线粒体膜电位（MMP）;超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒检测SOD活性;免疫印迹法（Western blotting）检测血红素氧合酶-1（HO-1）的表达。结果： 600 μmol/L CoCl2明显地降低H9c2心肌细胞内SOD活性、ATP水平及MMP,并增加HO-1表达。400 μmol/L NaHS 预处理可显著地抑制CoCl2诱导的细胞毒性及氧化应激反应,使SOD活性、ATP水平及MMP提高,HO-1表达减少。热休克蛋白90抑制剂17-丙烯胺基-17去甲氧基格尔德霉素（17AAG）能明显地阻断H2S对CoCl2诱导的细胞毒性和氧化应激反应的抑制作用,使细胞内ATP水平及MMP降低,HO-1表达增多,但对SOD活性的影响不明显。结论： 热休克蛋白90可通过抑制化学性缺氧引起的氧化应激反应来介导H2S的心肌保护作用。     

氯化钴诱导缺氧对血管周细胞血管生成素-1表达影响的研究

目的检测缺氧环境下缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素-1(Ang-1)表达变化,探讨氯化钴诱导缺氧对血管周细胞Ang-1表达的影响。 方法体外培养人脑血管周细胞,予不同浓度氯化钴诱导缺氧环境,分为对照组和试验组。对照组使用不含氯化钴的血管周细胞培养基培养;试验组使用血管周细胞培养基溶解六水合氯化钴稀释至终浓度分别为50 μmol/L(50 μmol/L氯化钴组)、100 μmol/L(100 μmol/L氯化钴组)、200 μmol/L(200 μmol/L氯化钴组)、300 μmol/L(300 μmol/L氯化钴组)、400 μmol/L(400 μmol/L氯化钴组)。通过蛋白质印迹法检测HIF-1α蛋白表达、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HIF-1α、Ang-1 mRNA合成以及酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测VEGF、Ang-1蛋白分泌。对数据行单因素方差分析、Dunnett-t检验及t检验。 结果对照组和各试验组(50、100、200、300、400 μmol/L氯化钴组)HIF-1α蛋白表达组间差异有统计学意义(F＝215.7,P<0.05);HIF-1α蛋白表达随氯化钴浓度先升高后降低,在200 μmol/L处相对灰度达到峰值8.6140±0.3445,200 μmol/L氯化钴组相对灰度值与对照组,50、100、300、400 μmol/L氯化钴组比较,差异均有统计学意义(t＝38.28、22.18、10.16、5.60、25.47,P值均小于0.05)。对照组与试验组HIF-1α mRNA表达组间比较,差异有统计学意义(F＝195.5,P<0.05);HIF-1α mRNA表达呈氯化钴浓度依赖性降低,400 μmol/L氯化钴组HIF-1α mRNA表达达到最低值5.107×10^－3±8.138×10^－5,与对照组,50、100、200 μmol/L氯化钴组比较,差异均有统计学意义(t＝21.40、17.75、14.96、5.36,P值均小于0.05)。对照组与试验组VEGF蛋白表达组间比较,差异有统计学意义(F＝93.34,P<0.05);VEGF蛋白表达随氯化钴浓度先升高后降低,在200 μmol/L处VEGF蛋白表达达到峰值(901.000±6.798) pg/mL,200 μmol/L氯化钴组与对照组,50、100、300、400 μmol/L氯化钴组比较,差异均有统计学意义(t＝27.70、10.56、4.65、10.49、17.97,P值均小于0.05)。对照组与试验组Ang-1蛋白表达组间比较,差异有统计学意义(F＝279.3,P<0.05);Ang-1蛋白分泌随氯化钴浓度升高先增加,在100 μmol/L处达到峰值(4 364.0±117.3) ng/mL,随后蛋白分泌随氯化钴浓度升高逐渐减少,100 μmol/L氯化钴组与对照组,50、200、300、400 μmol/L氯化钴组组间比较,差异均有统计学意义(t＝8.57、4.33、17.03、19.48、23.30,P值均小于0.05)。对照组与试验组Ang-1 mRNA表达组间比较,差异有统计学意义(F＝172.0,P<0.05);Ang-1 mRNA表达随氯化钴浓度升高先增加,在100 μmol/L处达到峰值6.732×10^－4±7.140×10^－6,随后mRNA表达随氯化钴浓度升高逐渐减少,100 μmol/L氯化钴组与对照组,200、300、400 μmol/L氯化钴组组间比较,差异均有统计学意义(t＝10.05、20.21、110.20、34.25,P值均小于0.05)。 结论轻度缺氧环境下,血管周细胞Ang-1表达随缺氧程度加剧而受到促进;重度缺氧环境下,血管周细胞Ang-1表达随缺氧程度加剧而受到抑制。     

[已撤稿]人视网膜色素上皮细胞在缺氧和高糖环境中VEGF165及VEGF165b的表达及意义

目的：研究体外培养的人视网膜色素上皮细胞在人工模拟的缺氧和高糖环境中VEGF₁₆₅ 及VEGF_165b 表达的情况。

方法：正常接种并体外培养人视网膜色素上皮细胞,待细胞稳定生长后以150μmol/L CoCl₂ 和25mmol/L 葡萄糖浓度分别模拟细胞缺氧和高糖环境,将接种细胞分为正常组(5.56mmol/L 葡萄糖)、缺氧组(5.56mmol/L 葡萄糖+150μmol/L CoCl₂)、高糖组(25mmol/L 葡萄糖,不加CoCl₂)、联合组(25mmol/L 葡萄糖+150μmol/L CoCl₂)共四组。每组分别于12、24、36、48h提取RNA。MTT 比色法检测细胞活力及增长趋势; RT-PCR 法检测不同时间点四组RPE 细胞VEGF₁₆₅ mRNA 和VEGF_165b mRNA 的相对表达量。

结果：缺氧和高糖环境下RPE 细胞分裂增殖受限,细胞活力降低。同一组细胞不同时间点比较,正常组VEGF₁₆₅和VEGF_165b随时间变化的表达差异无统计学意义(P >0.05),而缺氧组、高糖组、联合组VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达则随时间变化而变化,差异有统计学意义(P<0.05)。同一时间点各组相互比较,在缺氧模型建立后12h 各组细胞间VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达差异无统计学意义(P >0.05),而24、36、48h 时各组细胞VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：体外培养RPE细胞能够正常表达VEGF_165b,缺氧和高糖是在转录水平诱导VEGF₁₆₅ mRNA的表达上调,同时降低了VEGF_165b mRNA的表达量。     

氯化钴对乳鼠心肌细胞凋亡的影响

目的确定萌化钴(CoCl2)对乳鼠心肌细胞凋亡的影响。方法采用达氏修正依氏(DMEM)/F12(1∶1)培养基原代培养乳鼠心肌细胞,3d后分别给予浓度200、400、600μmol/L的CoCl2培养24h,对照组不加CoCl2。锥虫蓝染色检测细胞存活力,Hochest33258荧光染色检测细胞凋亡,用Western Blot检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白水平。结果与对照组比较,CoCl2培养组细胞存活率明显下降(P<0.01),凋亡率明显增加(P<0.01),且心肌细胞存活率下降程度及细胞凋亡率睁加程度均随着氯化钴浓度增加而升高。HIF-1α蛋白水平亦随CoCl2浓度升高而增加。结论CoCl2可模拟缺氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡。     

低氧诱导促红细胞生成素及其受体在人胚胎RPE细胞中的表达

目的研究促红细胞生成素（EPO）及其受体（EPOR）在人视网膜色素上皮（RPE）细胞化学低氧损伤中的表达及意义。方法原代培养人胚胎RPE细胞，应用不同浓度氯化钴造成RPE细胞化学缺氧，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测RPE细胞增生活力变化，采用免疫组织化学法检测EPO和EPOR在RPE细胞中的表达，应用weslern blot法检测EPO和EPOR蛋白的表达变化。结果不同浓度的CoCl2均促进细胞生长。正常人胚胎RPE细胞检测到EPO和EPOR的弱表达，CoCl2处理组检测到EPO和EPOR的强表达。结论化学缺氧促进人胚胎RPE细胞的增生，EPO及其受体EPOR可能在这个过程中起重要作用。