氯化钴作用人脐带间充质干细胞的差异蛋白质组学分析

目的 用蛋白质二维凝胶电泳图谱,结合质谱技术鉴定、分析化学低氧模拟剂氯化钴( CoCl2)作用人脐带间充质干细胞(MSC)前后蛋白质组的差异表达.方法 CoCl2作用人脐带MSC,应用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离细胞总蛋白.ImageMaster 2D Platinum软件分析差异蛋白质点,用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱对差异表达蛋白做质谱鉴定,对差异蛋白进行功能分类.结果建立了CoCl2作用人脐带MSC的蛋白质组图谱,鉴定出26个差异表达蛋白,其中11个表达上调,15个表达下调.其生物学功能涉及糖代谢、蛋白质代谢和修饰、脂类代谢、辅酶与辅基、细胞周期、免疫和防御、细胞结构和运动、信号转导、蛋白靶向和定位、神经细胞的活动、肌肉收缩等.其中过氧化物还原酶-1(Prdx1)表达下调,α-烯醇化酶(ENO1)、单胺囊泡转运蛋白1(VAT1)表达上调.结论 低氧对人脐带MSC的影响涉及多蛋白及多个功能通路.     

CoCl2化学模拟肝癌体外缺氧模型的建立及对HIF-1α、VEGF基因的影响

目的观察不同浓度的氯化钴(CoCl_2)对人肝癌细胞生长及及其诱导化学性缺氧的最佳浓度和时间。方法通过不同浓度(0～800μmol/L)CoCl_2处理不同肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、SMMC-7721和Bel-7402)24 h,利用CCK-8法检测四种人肝癌细胞株细胞存活率;选取100、200、300、400μmol/L CoCl_2作用不同肝癌细胞系0、12、24、48、72 h,利用CCK-8法检测四种人肝癌细胞株细胞存活率;确定最佳诱导浓度200μmol/L后,分别于0、6、8、12、24 h应用Real-time PCR检测VEGF mRNA的转录;确定好最佳诱导时间,采用Western-blot方法检测评估100、200、300、400μmol/L CoCl_2作用不同肝癌细胞系24 h后表达HIF-1α蛋白情况。结果 CoCl_2浓度在200μmol/L以内对人肝癌细胞株的生长无明显的抑制作用,当浓度大于200μmol/L、诱导时间大于24 h后明显抑制细胞生长,且抑制作用随着浓度的增加而增强(P0.05)。200μmol/L CoCl_2刺激四种肝癌细胞0、6、8、12、24 h时VEGF mRNA转录递增。200μmol/L CoCl_2刺激细胞24 h时,能诱导并稳定维持四种肝癌细胞HIF-1α蛋白表达。结论 CoCl_2诱导肝癌细胞化学性缺氧的最佳浓度为200μmol/L,此时最佳时间为24 h。     

HIF-1α对胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响

目的 探讨氯化钴(CoCl2)模拟化学缺氧复氧中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的表达及其对人胶质瘤U251细胞增殖及侵袭的影响.方法 在培养基中加入和去除CoCl2模拟化学缺氧和缺氧复氧,采用免疫印迹法(Western blot)检测CoCl2与HIF-1α蛋白表达关系;通过MTT、过河实验、黏附试验分别检测细胞侵袭、迁移运动能力和黏附能力.结果 人胶质瘤U251细胞中存在HIF-1α蛋白表达;在CoCl2模拟缺氧的时-效关系实验中,100μmol/L CoCl2刺激细胞6h、12h、24h时HIF- 1α蛋白呈递增(分别 为1.024±0.03、2.35±0.04、2.82±0.12)(P<0.05),24h达高峰,48h明显下降(1.82±0.05).同时,在量-效关系实验中,CoCl2 50μmol/L、100μmol/L和150μmol/L刺激细胞24h时HIF-1α蛋白呈递增(分别为1.78±0.03、1.81±0.03、2.12±0.12)(P<0.05);MTT发现CoCl2诱导的缺氧对细胞增殖起抑制作用;过河实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的迁移运动能力增加;细胞黏附实验发现缺氧24h复氧24h后细胞的黏附力增加.结论 CoCl2能诱导人胶质瘤U251细胞HIF-1α蛋白过度表达,而且存在一定的时-效关系;经CoCl2诱导的缺氧后复氧,肿瘤细胞增殖能力下降,细胞的迁移运动能力和黏附能力增加.     

低氧对人白血病细胞株HL-60细胞增殖及HIF-1α表达的影响

目的探讨模拟低氧环境对人白血病细胞株HL-60细胞增殖及低氧诱导因子表达的影响。方法常规方法复苏、传代培养细胞,待细胞进入对数生长期后用于实验。将细胞分为低氧处理组和常氧对照组,常氧对照组采取常规培养,低氧处理组分别用50、200、400、800μmol/L二氯化钴(CoC12)处理,并于24、48、72 h收集细胞进行以下指标检测:≧倒置相差显微镜观察细胞形态变化;≧MTT比色法检测细胞增殖抑制率;≧实时荧光定量PCR检测HIF-1α在转录水平的表达。结果 1:低氧模拟环境下,细胞在形态上呈较明显变化,并随CoCl2浓度和处理时间的延长变化显著;2:MTT实验结果显示,与常氧对照组比较,CoCl2处理组均产生明显抑制作用,抑制率随着药物浓度增加而增大;3:实时荧光定量PCR结果表明,与对照组(24 h)相比,50μmol/L CoCl2和200μmol/L CoCl2低浓度处理组HIF-1αmRNA的表达均有上调,且上调呈剂量和时间依赖关系。结论 1:CoCl2模拟低氧后,细胞生长明显受抑;2:低浓度(50~200μmol/L)CoCl2组HIF-1αmRNA表达上调并呈现时间、浓度依赖性;3:本研究涉及的低氧模拟环境对HL-60细胞未引起明显的诱导分化现象。     

镍铬钴混合物对小鼠免疫毒性的研究

目的：研究镍、铬、钴混合物对免疫功能的影响，对治疗混合物联合毒性提供理论依据。方法：模拟金川矿区矿石中Ni,Cr,Co平均含量百分比（0．26：0．30：0．02），连续10d小鼠腹腔注射染毒。采用特异性免疫指标：血清凝集素、溶血素、抗体分泌细胞、α-ANAE^ 率、体内淋巴细胞转化率和非特异性免疫指标：巨噬细胞吞噬率、吞噬指数、观察混合物毒性。结果：混合物可导致各项免疫指标降低，抑制机体免疫功能，尤以混合物大剂量组显著。结论：混合物在体内可能产生联合毒作用，导致机体免疫功能低下，其联合毒作用特征可能是相加作用。     

氯化钴诱导上皮间充质转化并增加胶质瘤T98G细胞侵袭能力的研究

目的研究氯化钴对胶质瘤T98G细胞上皮间充质转化(EMT)和侵袭能力的影响。方法用氯化钴处理胶质瘤T98G细胞,未处理组作为对照,Western blot检测各组细胞上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和间充质细胞波形蛋白(Vimentin)的表达,采用Transwell及Boyden方法检测各组迁移细胞数。结果氯化钴处理胶质瘤T98G细胞后发生了典型的EMT:E-cadherin表达明显降低(P<0.05或P<0.01),Vimentin表达明显升高(P<0.01);Transwell迁移实验显示迁移能力明显增强:穿过Transwell小室滤膜的细胞数由(29±5)个增加至(53±4)个(P=0.0397);Boyden结果显示:穿过小室细胞数由(26±3)个增加至(36±2)个(P=0.0402)。结论氯化钴能促进胶质瘤T98G细胞发生EMT,增强胶质瘤T98G细胞迁移能力。     

iPSC-MSCs对CoCl_2诱导的PC12细胞损伤时线粒体功能的影响

目的:观察诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞(i PSC-MSCs)对氯化钴(Co Cl2)诱导的PC12细胞损伤的影响,并探讨其可能机制。方法:用Co Cl2处理PC12细胞建立化学损伤模型,加入i PSC-MSCs共培养。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)比色法检测细胞存活率,Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡比率,JC-1染色流式细胞术检测细胞线粒体膜电位,免疫荧光观察i PSC-MSCs向PC12细胞转移线粒体的情况。结果:用Co Cl2(400μmol/L)处理PC12细胞24 h可使其凋亡明显增多,线粒体膜电位明显下降。与i PSC-MSCs共培养能减轻PC12细胞的凋亡,使其膜电位恢复。i PSC-MSCs可以与PC12细胞间形成隧道纳米管并向PC12细胞转移线粒体。结论:i PSC-MSCs可以减轻Co Cl2诱导的PC12细胞损伤,机制可能与其向PC12细胞转移线粒体有关。     

低氧条件对小鼠ADSCs膜片形成及其生物学特性的影响

目的:观察低氧条件对小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)膜片生物学性能的影响.方法:分离培养C57/BL小鼠ADSCs并用Vit C法构建细胞膜片;氯化钴(CoCl2)模拟体内低氧环境,qPCR和Western Blot检测HIF-1α表达;组织学染色、透射电镜观察膜片形成;qPCR检测ADSCs干性及膜片分泌功能相关基因的表达.结果:成功构建ADSCs膜片;HIF-1α的表达随CoCl2浓度的升高而升高;低氧条件下,形成细胞膜片较薄,但膜片内细胞连接更紧密;低氧环境可增强ADSCs干性,促使ADSCs膜片合成更多黏附分子、分泌更多保护性生长因子.结论:低氧条件更利于ADSCs膜片构建、存活和生物学功能维持.     

CoCl2诱导黑素瘤A375细胞上皮间质转化、糖酵解及SB-431542干预研究

目的探讨CoCl2刺激的黑素瘤A375细胞上皮间质转化和糖酵解的作用机制及SB-431542对此的干预作用。方法选用本团队前期已证实的安全有效浓度的CoCl2（50～150μmol/L）刺激黑素瘤A375细胞,建立体外低氧模型,Western Blot检测HIF-1α、Nodal、上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、Vimentin、MMP2及糖酵解各组分蛋白LDH-A、LDH-B的表达,以明确CoCl2对A375细胞上皮间质转化和糖酵解的影响作用。随后研究SB-431542对Nodal-ALK4-ALK7介导A375细胞上皮间质转化和糖酵解反应的抑制作用:本部分拟筛选安全有效浓度的Nodal受体抑制剂（SB-431542）分别作用于CoCl2介导的低氧模型,通过MTT实验确定SB-431542的安全浓度用于后续实验。Western blot检测SB-431542对CoCl2诱导细胞上皮间质转化和LDH活化相关蛋白的影响;琼脂糖凝胶电泳检测LDH同工酶谱的变化情况;此外,使用Western blot检测Nodal及其受体（ALK4、ALK7）的表达。结果 CoCl2可显著上调细胞上皮间质转化相关蛋白Vimentin、MMP2和促瘤相关蛋白Nodal及其受体（ALK4、ALK7）的表达,且表达与作用浓度成正相关; CoCl2能促进糖酵解活化相关蛋白表达,其中LDH-A表达上调,LDH-B的表达受到抑制（P<0.05）。MTT结果显示10μmol/L SB-431542处理48 h对细胞的增殖影响最小（P<0.05）; SB-431542可抑制Vimentin、MMP2和Nodal及其受体ALK4、ALK7表达（P<0.05）;促进糖酵解途径的相关蛋白LDH-A的表达下调（P<0.05）,抑制糖酵解途径相关蛋白LDH-B的表达上调（P<0.05）。结论CoCl2可诱导黑素瘤细胞上皮间质转化及糖酵解。SB-431542可通过抑制CoCl2诱导的Nodal-ALK4-ALK7信号通路抑制与上皮间质转化及糖酵解相关分子的表达。     

镍铬钴混合物对小鼠肝脏毒作用机制的研究

目的：探讨镍铬钴混合物致小鼠肝脏损伤的机制，为早期防治镍铬钴混合物联合毒性所致的肝脏损伤提供理论依据。方法：模拟金川矿区矿石中Ni、Cr、Co平均含量百分比（0．26：0．30：0．02），连续10d小鼠腹腔注射硫酸镍2．5mg/kg、重铬酸钾0．14mg/kg、氯化钴0．41mg/kg及混合物0．09，0．17mg/kg染毒。制备肝细胞膜，采用定磷比色法检测肝细胞膜Ca^2 -ATPase活性；PDE法检测钙调素（CaM）含量；TBA法检测MDA含量和邻苯三酚自氧化改进法测定SOD活性。结果：各单体和混合物明显抑制肝细胞膜Ca^2 -ATPase活性，使肝组织中钙调素（CaM）含量降低，MDA含量升高的同时抑制SOD活性，尤以混合物组显著，并且混合物毒性大于各单体毒作用。结论：混合物在体内可能产生联合毒性，抑制肝细胞膜Ca^2 -ATPase活性，使钙调素（CaM）含量降低，导致钙稳态失衡；同时引起肝细胞脂质过氧化作用增强而致肝脏损伤。