人era的结构特点分析及其定点突变体的构建

目的：构建最近克隆的人era基因的定点突变体。方法：利用数据库对era的结构特点进行分析，在此基础上用改良的重叠延伸法分别构建人EraN端和C端的定点突变体。结果：获得了分别针对人EraN端TGP结合结构域（位于29－36氨基酸残基）和C端具有RNA结合活性的 KH结构域（位于297－340氨基酸残基）的定点突变体。结论:人era定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。     

地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应

为了检测pcDNA-L1的表达，评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应。我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因，以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1，进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析，再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1(-)中，构建重组pcDNA-L1，转染Cos-7细胞，通过IFA试验验证L1蛋白的表达。     

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段.方法:采用PCR技术从含人MASP1 cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性.结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和860 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合.结论:获得了表达人MASP1 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1 N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件.     

表达幽门螺杆菌过氧化氢酶的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其免疫保护作用的观察

目的 探讨表达幽门螺杆菌（Hp)过氧化氢酶（KatA)的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株在防御Hp感染中的作用。方法 构建表达KatA的重组质粒,用IPTG进行诱导表达,再将其转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261株中构建成口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,并以Hp翻尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和Hp定量培养对胃粘膜中的Hp进行检测。结果 SDS-PAGE凝胶电泳上显示一条相对分子质量约79000的新生蛋白带,占细菌总蛋白的19%,并能与抗谷胱甘肽-s-转移酶（GST）抗体发生特异性反应,动物实验结果显示;免疫小鼠能有效防御Hp的感染,结论 表达KatA的减毒沙门氏菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用。     

Endostatin基因真核表达载体的构建及活性鉴定

目的：构建endostatin基因的真核表达载体,并将其转染C6脑胶质瘤 细胞,探讨其体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR将大鼠血清蛋白分泌信号连接在endostatin基因的碳末端,构建成真核表达载体pcDNA3-Sendostatin,利用Lipofectamine法将其转染C6脑胶质瘤细胞,采用细胞增殖实验进行endostatin表达蛋白体外活性鉴定。结果：成功构建了endostatin基因真核表达载体,转染该载体的C6脑胶质瘤细胞可分泌表达抑制血管内皮细胞增生的endostatin蛋白。结论：endostatin是一种有效的血管生成抑制剂,可进一步用于在体肿瘤的抗血管生成治疗。     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

单链抗体构建、表达及临床应用的研究现状

<正> 7O年代,德国学者Kohler和英国学者Mil- stein利用细胞融合技术第一次研制了单克隆抗 体(McAb)。今天,它已经对医学、生物学、免疫学 等诸多学科的发展发挥着巨大的作用。然而,由于 目前制备的单克隆抗体多为鼠源性的,在体内易 产生人抗鼠的抗体反应,加之其分子量大,血管通 透性差,给临床应用带来了一定的困难。而来自人 的单抗的研究尚有一定的难度。近年来,随着基因 工程日新月异的发展,通过大肠杆菌可表达具有 生物活性的抗体片断,通过PCR技术的不断完 善,快速克隆抗体某一基因的可变区成为可     

重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体, 研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ 重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２ （ＢＭＰ－２） 成熟肽的０．３６ ｋｂ 基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７ （ＢＭＰ－７） 成熟肽的０．４４ｋｂ 基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７ 融合基因; 经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。克隆质粒转化的工程菌,经４２℃诱导４～６ ｈ 后,高效表达重组人骨形态发生蛋白－２／７, 在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一新的蛋白带, 分子量约２９ ｋｕ,约占菌体总蛋白的２０％ ,表达蛋白以包涵体的形式存在,经初步纯化、裂解、复性后的ＢＭＰ－２／７ 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。ＢＭＰ－２／７ 融合基因的构建和表达,可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白     

甲状腺癌差异表达cDNA消减文库的构建

目的 应用抑制性消减杂交技术，构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法 分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA，应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术，构建成功cDNA消减文库，再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果 构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库，文库扩增得到了400个克隆，随机挑取50个制备质粒，酶切分析均得到50bp-400bp大小插入片段，这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论 人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。