血管内皮生长因子在原核细胞中的活性检测术

背景:目前血管内皮细胞生长因子制备困难,来源有限,限制了临床的应用.目的:用基因工程的方法在人肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165,分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性.为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2005-04/2007-01在陕两省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:携带目的基因血管内皮生长因子165的克降质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建,PGEM-T easv 质粒购自美国Promerga公司,原核表达质粒购自德国Qiagen公司,DH5 α、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存.方法:利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段,构建表达质粒pQE30-VEGF165,在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2 -NTA进行蛋纯化.经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白.主要观察指标:①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果.②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果.③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化.④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性.⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性.结果:重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23 000的蛋白,其以不溶性的包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%左右,经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白,浓度约为0.2g/L,ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性.结论:实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白,为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源.     

Nogo-66蛋白氨基酸肽的克隆及在原核细胞的表达

目的: 克隆编码Nogo-66氨基酸多肽基因,构建原核重组表达载体,并诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法: 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增出编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,将其克隆于T载体PMD18-T,酶切鉴定后再亚克隆于原核表达载体pET-42a(+),酶切及测序证实序列正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白-Nogo-66。结果: 克隆了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,构建了融合蛋白的重组表达质粒,融合蛋白的表达随着时间延长增加。结论: 获得了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因及其原核表达产物,对研究Nogo蛋白的生物学功能及其mAb的制备奠定基础。     

老年神经变性疾病机制研究的基础：人α—突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达

目的：为提供人α—突触核蛋白(α—synuclein)抗原，制备抗体以研究其自身聚集在老年神经变性疾病病理机制中所起作用，重组质粒载体、进行DNA测序，以用于α—突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达。方法：将质粒pcDNA3NACO(pcDNA3α-svnuclein cDNA)和质粒载体proEXMTHT1分别进行酶切，取α—突触核蛋白cDNA片段，重组于proEX MTHT1质粒载体上；酶切鉴定后测序；再将重组质粒proEXNACP转染进入DH5α大肠杆菌体内；用IPTG诱导α—突触核蛋白基因产生蛋白；将α突触核蛋白纯化后行Western杂交。结果：质粒pnoEX MTHT1和pcDNA3NACP经限制性内切酶消化分别得到4750bp和550bp DNA片段。α—突触核蛋白基因在原核细胞中蛋白表达量为10mg／L。表达蛋白经Western杂交证实为α—突触核蛋白。结论：α—突触核蛋白基因在原核细胞的蛋白表达可作为体内外研究老年神经变性疾病病理机制的基础研究。     

女性不孕症与解脲支原体、沙眼衣原体感染的临床观察

解脲支原体（vv）和沙跟衣原体（CT）均属寄生于生殖道的原核细胞微生物，作为人类性传播疾病（STD）的常见病原体，不仅使生育期妇女通过性接触感染而引起阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、急慢性输卵管炎和盆腔炎等生殖道感染，还可导致不孕，为了解女性不孕症中下生殖道UU、CT感染情况，探讨其与不孕症的关系，对2007年5月-2009年2月本站收治的120例不孕妇女宫颈分泌物进行UU、CT检测，现将结果报告加下.     

乙型脑炎病毒prM蛋白单克隆抗体的制备

目的 克隆日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)前膜蛋白(prM)编码基因,原核表达、纯化prM蛋白,以纯化产物为免疫原制备单克隆抗体(mAb);方法从感染JEV病毒的鼠脑中克隆编码JEV prM蛋白的基因并将其克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠埃希菌BL21(DE3)LvsS后以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA纯化后进行SDS-PAGE分析.用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和亚克隆后筛选出能分泌识别prM蛋白的mAb的杂交瘤细胞株.用Western Blot和免疫组化方法检测单克隆抗体的特异性.结果 从鼠脑中克隆出约500 bp的JEV prM基因,将其克隆入原核表达载体中,在大肠埃希菌中获得了较好表达.纯化的prM蛋白免疫BALB/c小鼠,经传统细胞融合及筛选方法制备出单克隆抗体,抗体滴度为105.ELISA、Western Blot和免疫组化检测结果证实该株单抗具有较好的特异性.结论 成功的表达和纯化了日本乙型脑炎病毒的prM蛋白,并完成了单克隆抗体的制备,为乙型脑炎病毒感染的早期诊断及预防的研究奠定了良好的基础.     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因原核表达质粒的构建与表达

目的 构建人呼吸道合胞病毒（hRSV）MS－1基因原核表达质粒载体,使其于原核细胞中表达。方法 利用Hep-2细胞培养hRSV,提取感染细胞总RNA,通过RT－PCR扩增M2－1基因片段。目的片段与质粒pGEX-2Tx EcoRI、XhoI双酶切后,连接、转化,筛选出阳性克隆。阳性克隆菌经诱导剂诱导后,表达M2－1融合蛋白。结果 成功地构建了M2－1基因原核表达质粒载体,实现了其于原核中的表达。结论 建立了hRSV基因M2－1原核表达载体,为进一步研究hRSV奠定基础。     

卵细胞质内单精子注射后多原核发生率对胚胎发育和妊娠结局的影响

目的：探讨多原核（pronucleus,PN）发生率对卵细胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）胚胎发育和妊娠结局的影响。方法：回顾性分析南京医科大学附属妇产医院生殖医学中心2016年1月—2021年12月行ICSI助孕治疗患者的临床资料。根据多PN发生率分为3组：对照组（多PN发生率=0%,n=333）、低频多PN组（0%<多PN发生率<20%,n=80）和高频多PN组（多PN发生率≥20%,n=31）。分别比较各组间胚胎发育潜能及妊娠结局情况。结果：与对照组相比,低频多PN组的获卵总数、D3可利用胚胎数增多,正常受精率降低（均P<0.017）。与对照组和低频多PN组相比,高频多PN组正常受精率、D3可利用胚胎数显著降低（均P<0.017）;虽然生化妊娠率低、流产率高,但是差异无统计学意义（P>0.017）。多因素二元Logistic回归分析结果显示,与对照组相比,高频多PN组生化妊娠率（a OR=0.402,95%CI:0.186～0.870,a P=0.021）和活产率（a OR=0.247,9...     

甲3型流感病毒M基因披甲RNA的研制

目的 研制内含甲3型流感病毒M基因RNA的披甲RNA.方法 将MS2噬菌体基因组中编码成熟酶蛋白、包膜蛋白和pac位点的DNA片段克隆到表达质粒pET30b中,构建重组质粒pAR-1.将甲3型流感病毒M基因连接到pAR-1 pac位点的下游,诱导表达出内含M基因RNA的披甲RNA AR-2,并进行纯化、定量和稳定性研究.结果 成功构建和表达了耐核糖核酸酶、内含M基因RNA的披甲RNA,每1 ml LB培养基可诱导表达出约8.9×1011个拷贝的AR-2.结论 制备的AR-2稳定,无生物传染危险性,可作为甲型流感病毒M基因核酸检测的标准品和质控品.     

神经元烟碱受体β2亚基基因克隆和原核细胞表达

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法从孵育至１２天的鸡胚视叶顶盖中提取ＲＮＡ。ｃｈｏｅｐｆｅｒ报道的序列设计引物，引物的５端添加ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切位点。通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）得到１．４８ｋｂ长的ＣＤＮＡ片段，用ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切ＣＤＮＡ后插入质粒ＰＵＣ１９。测序采用Ｓａｎｇｅｒ双氧终止法，结果与文献报道一致。将β基因克隆入ＰＢＶ２２０原核表达载体中，宿主菌经４２℃诱导，经ＳＤ     

GCRG224在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224,制备高纯度的GCRG224蛋白。方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达融合蛋白,凝胶回收目的蛋白。结果:SDS-PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约16.8ku的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%。经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品。结论:在大肠杆菌中成功表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并制备了高纯度的蛋白产品,为后续功能研究及其抗体研制创造了条件。