Efficient expression of histidine-tagged large hepatitis delta antigen in baculovirus-transduced baby hamster kidney cells

AIM: To study the baculovirus/mammalian cell system for efficient expression of functional large hepatitis delta antigen (L-HDAg). METHODS: A recombinant baculovirus expressing histidine-tagged L-HDAg (L-HDAgH) was constructed to transduce baby hamster kidney (BHK) cells by a simplified transduction protocol. RESULTS: The recombinant baculovirus transduced BHK cells with efficiencies higher than 90% as determined by flow cytometry. The expression level was significantly higher than that obtained by plasmid transfection and was further enhanced 3-fold to around 19 pg/cell by the addition of 10 mmol/L sodium butyrate. Importantly, the expressed L-HDAgH was localized to the cell nucleus and correctly isoprenylated as determined by immunofluorescence labeling and confocal microscopy. Moreover, L-HDAgH interacted with hepatitis B surface antigen to form virus-like particles. CONCLUSION: The fusion with histidine tags as well as overexpression of L-HDAgH in the baculovirus-transduced BHK cells does not impair the biological functions. Taken together, the baculovirus/mammalian cell system offers an attractive alternative for high level expression of L-HDAgH or other proteins that require extensive posttranslational modifications.     

人纤维介素蛋白2在昆虫杆状病毒系统中的表达及活性检测

目的:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf9细胞)中表达人纤维介素蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶并检测其蛋白活性.方法:首先将PCR扩增的目的基因hfgl2和pENTR/D-TOPO载体连接,再将pENTR/D-TOPO-hfgl2质粒与BaculoDirectTM线性DNA进行体外基因重组,采用脂质体转染法将重组DNA转染到生长良好的Sf9细胞中进行病毒包装,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用RT-PCR和Western blotting从基因和蛋白水平检测hfgl2表达情况,一期凝固试验检测其蛋白活性.结果:重组杆状病毒感染后,Sf9细胞停止生长,体积变大,细胞开始悬浮,破裂,呈现颗粒样外观.RT-PCR扩增和Western blotting从基因和蛋白水平证实Sf9细胞能够表达hfgl2,蛋白分子量约为63kDa.同时,在细胞上清液中检测到了可溶性hfgl2的表达,蛋白分子量约为50kDa.一期凝固试验证明表达的跨膜型hfgl2具有凝血活性.结论:hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性,为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具,亦可应用于开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒.     

以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法

目的：报道一种新的基因治疗方法。方法；将人全长血小板生成素基因克隆至ｐＢａｃＭａｎ－２载体，与Ｂａｃ Ｖｅｃｔｏｒ－３０００病毒ＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９细胞，经筛选后获得可在哺类动物细胞高效表达的昆虫病毒，以此为载体，将人ＴＰＯ基因导入小鼠体内。结果：获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株，动物实验外周血小板计数升高至正常的２￣３倍，ＲＴ－ＰＣＲ结果显示ＴＰＯ在小鼠组织中得到表达。结论：重组ｒｈ     

实时荧光PCR和核酸点杂交技术在白斑病毒检测应用比较

对虾白斑病毒综合症(WSSV)是由白斑杆状病毒引起，在病毒性虾病中危害最为严重，目前一般采用核酸探针点杂交技术对白斑病毒进行定性检测。今年我们在卫生部传染病重点实验室的指导帮助下研究开发实时荧光定量PCR技术检测该病毒(目前仍为定性检测)，并用两种方法对对虾样品进行检测，现将结果比较如下：     

家蚕“生物反应器”生产生物制品的方法

该项目属于生物制药领域。从1986年起，该项目得到国家“七五”、“八五”、“九五”、“十五”科技重点攻关计划和“863”计划等的立项支持，对家蚕“生物反应器”生物制药上游和下游产业化生产技术进行了攻关研究。筛选出优良的蚕品种，构建新型家蚕杆状病毒表达系统，以家蚕蛹作为“生物反应器”高效表达了人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(hGM—CSF）等60余种医用蛋白质，解决了家蚕“生物反应器”生物制药的产业化关键技术，建立了家蚕“生物反应器”生物制药的技大平台。     

抗甲肝病毒人源基因工程全抗体分子在杆状病毒中的表达

目的 探讨人源抗甲型肝炎病毒全抗体分子在杆状病毒中的表达。方法 将获得的人源抗甲肝病毒中和性抗体Fab段基因克隆入含信号肽及Fc的杆状病毒表达载体中并在杆状病毒细胞中表达。结果 获得了中和性人源抗甲肝病毒全抗体分子的表达产物并进行了纯化，轻重链表达产物位置大小正确，HAFc16抗体能与具有中和活性的鼠抗甲肝病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应，并能在体外中和甲肝病毒，另一株HAFc78抗体同样具有体外中和甲肝病毒的活性，但系抗不同位点的抗体。结论 获得的人源抗甲肝病毒全抗体分子表达产物具有很好的体外中和甲肝病毒的活性，且为抗不同位点的抗体，为这些抗体的进一步开发及应用打下了基础，为防止甲型肝炎暴发流行提供应急措施。     

HPV16 L1-E7c嵌合基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达及免疫小鼠的效应研究

目前,关于人乳头瘤病毒疫苗的研究主要集中在嵌合型病毒样颗粒(cVLP)上。本研究制备了昆虫细胞表达的HPV16L1E7cCVLP,并将该蛋白疫苗接种动物,探讨其诱发体液免疫应答和细胞因子的效应。1材料和方法酶切pUC19L1E7c获得L1E7c基因,与杆状病毒转移载体pFastBac1连接,转化DH10Bac菌。PCR扩增L1E7c鉴定重组质粒。BacmidDNA与Cellfectin混合,转染SF9细胞,培养3～6d。进行15%SDS PAGE电泳和WesternBlot,兔抗HPV16L1和E7抗体由美国Galloway教授惠赠。HPV16L1-E7cVLP纯化后做为疫苗。选择6～8周龄BALB/c小鼠,每组6只。第1组…     

以新型杆状病毒载体在昆虫、哺乳动物细胞中表达克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白基因

目的 构建可以在哺乳动物细胞中高效表达的新型杆状病毒载体，并利用其将克里米亚—刚果出血热病毒(CCHFY)中国分离株(新疆出血热病毒，xHFY)BA88166的核蛋白(NP)基因在昆虫和哺乳动物细胞中进行表达。方法 将人巨细胞病毒(CMv)立即早期(IE)启动子连接至杆状病毒载体PFastBacl多角体启动子下游形成新载体PCB1，然后将xHFY NP基因克隆至该载体，通过重组质粒转染和病毒感染，检测其在哺乳动物细胞(COS—7和vero)及昆虫细胞中的表达。结果 连接至PCB1的xHFV NP基因均能在相应的细胞中获得良好表达；以重组杆状病毒感染的vero细胞可以作为抗原检测xHF血清，与ELISA的检测结果完全一致，并与临床诊断有很好的平行性。结论 新型杆状病毒载体能够驱动外源基因在昆虫和哺乳动物细胞中高效表达，不仅能方便快速地制备诊断抗原，还具有发展重组病毒疫苗和基因治疗的潜力。     

抗癌胚抗原单链抗体基因与Mn-SOD基因的融合及在昆虫细胞中的表达

将抗癌胚抗原单链抗体基因与锰 超氧化物歧化酶基因融合 (ScFv Mn SOD )插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTb中 ,经大肠杆菌DH1 0Bac体内转座 ,产生重组杆状病毒pBacHTb Mn SOD ScFv。将其转染粉纹夜蛾Tn 5B1 4细胞 ,经扩增后在细胞内进行表达。SDS PAGE分析结果表明 ,融合基因得到高效表达 ,其表达产物相对分子质量为 40 0 0 0单体和 1 60 0 0 0左右的四聚体。Western印迹分析结果 ,以 6×His单克隆抗体为一抗进行蛋白印迹在相对分子质量 40 0 0 0单体和 1 60 0 0 0四聚体处可见表达条带 ,放射免疫分析表明重组杆状病毒表达ScFv Mn SOD融合蛋白能与CEA有较高的结合力 ,并且此融合蛋白具有特异SOD酶活性 ,酶比活可达 32 6 5u/mg。