诺如病毒病毒样颗粒的表达及其与Caco-2细胞的结合活性研究

目的在杆状病毒表达系统转染的昆虫SF-9细胞中表达诺如病毒（NorovirUSes,NoV）的衣壳蛋白VPl,并芎令证其与Caco-2细胞的结合活性。方法利用杆状病毒表达系统转染的昆虫SF-9细胞进行诺如病毒VPl蛋白表达,用蔗糖密度梯瞍超速离心方法纯化,采用Westernblot鉴定表达产物,采用流式细胞术检测NoV病毒样颗粒（Virus-likeparticles,VLPs）与Caco-2细胞的结合活性。结果重组质粒转染细胞表达产物经蔗糖密度梯度超速离心后进行SDS~PAGE,在分子质量单位55~70ku之间有3条蛋白带,与预期重组蛋白NoV—VI-Ps大小相符;Westernblot分析各蛋白组分均能被兔抗NoV多抗血清识别;流式细胞仪分析届示,加入重组蛋白NoV—VI—Ps后荧光信号较阴性对照组显著增强,表明表达的重组蛋自NoV—VI．Ps能够与Caco-2结合,且3个组分的结合能力不同（P〈i0·05）,以组分5与Caco-2细胞结合的能力最强（P〈O．05）。结论NoVVI．Ps表达成功,并证明NoV-VI—Ps具有与Caco2细胞结合活性,为N。V疫苗的开发和防治药物的研制奠定了基础。     

利用穿梭质粒快速构建含乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg …

目的 应用新型杆状病毒表达系统快速构建含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒，高效表达ＨＢｓＡｇ，为ＨＢＶ诊断试剂、疫苗及治疗研究提供依据。方法 构建含有ＨＢｓＡｇ基因的供体质粒ｐＦＢ－ＢＳ，转化Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达试剂盒中的ＤＨ１０Ｂａｃ致敏菌，利用其含有的细菌Ｔｎ７转座繁忙将ＨＢｓＡｇ基因重组至穿梭质粒Ｂａｃｍｉｄ上，快速筛选出含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒。结果 此重组病毒能在昆虫细     

抗癌胚抗原鼠人嵌合抗体重、轻链基因在昆虫细胞中的表达

本文采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf_9,秋粘虫细胞)中表达了抗癌胚抗原(CEA)鼠-人嵌合抗体重、轻链基因.将鼠源性单抗杂交瘤细胞中已克隆到的重、轻链可变区(V_H、Vk)基因分别与人免疫球蛋白恒定区基因Cr_3、Ck相拼接,构建鼠人嵌合抗体基因.含嵌合抗体基因的转移载体与线性化病毒DNA共转染Sf_9细胞,并通过点杂交、PCR扩增和Southern blot分析获得重组病毒.Western blot分析表明以重组病毒感染的Sf_9细胞分别表达了嵌合重链和轻链,放射免疫分析法(RIA)和间接ELISA测定的结果表明嵌合重、轻链基因表达产物具有与CEA结合的能力.     

重组小鼠MIG趋化因子的高效真核表达及免疫活性测定

目的 克隆小鼠CXC趋化因子干扰素-γ诱生单核因子（MIG）并在杆状病毒表达系统中进行高效表达，进而对MIG蛋白进行纯化和活性鉴定。方法从小鼠脑组织中用RT-PCR的方法扩增出小鼠MIG基因的全长cDNA，在克隆入Bae-to-Bac杆状病毒表达载体后在High-Five昆虫细胞中进行分泌型表达；表达产物经S-Sepharose进行了纯化并进行了生化鉴定；最后对纯化的重组小鼠MIG蛋白进行了钙离子内流诱发试验和淋巴细胞趋化测定以鉴定其免疫活性。结果成功克隆了小鼠MIG基因并在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中进行了高效表达，其表达蛋白主体相对分子质量约为15000；经过单步S-Sepha-rose纯化法就可获得纯度为85％以上的重组小鼠MIG蛋白，产量为10mg/L；该蛋白该纯化蛋白在体外具有诱导小鼠T淋巴细胞钙离子内流和吸引、趋化小鼠脾细胞的活性。结论小鼠MIG蛋白可在杆状病毒表达系统中高产量分泌表达并可用S-Sephavose纯化法直接纯化；小鼠重组MIG蛋白具有激活、趋化淋巴细胞的生物活性；rmMIG纯化蛋白的大量制备为进一步研究小鼠MIG蛋白在炎症、免疫器官的成熟和其它疾病中的功能和作用提供了有利的工具。     

重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定

目的克隆人凝血因子Ⅷ（Human Coagulation FactorⅧ,rhFⅧ）基因cDNA,利用bac-to-bac杆状病毒表达系统制备具有高凝血活性rhFⅧ。方法利用PT-PCR和overlap PCR技术扩增人FⅧ基因,亚克隆至转移载体pFastBac HTB,进一步转化至感受态细菌DH10Bac（含穿梭载体Bacmid）中,同源转座、氨苄青霉素及蓝白斑筛选阳性克隆质粒Bacmid/rhFⅧ;PCR法鉴定重组质粒后转染昆虫细胞Sf9;利用病毒感染High five细胞进行蛋白表达,通过SDS-PAGE、Western blot及凝血活性检测方法分析蛋白表达。结果完成了rBac-rhFⅧ重组杆状病毒的制备,实现了rhFⅧ在昆虫细胞中的重组表达,rhFⅧ相对分子质量为184 kDa左右,SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致,同时具有良好的促凝血作用。结论利用杆状病毒-昆虫表达系统成功制备了具有一定促凝血活性的rhFⅧ,为人凝血因子Ⅷ进一步的开发及应用奠定了基础。     

淡色库蚊乙酰胆碱酯酶基因上的可变剪接及对酶活性的影响

在淡色库蚊的乙酰胆碱酯酶ace1基因上发现了1个可变剪接,与实验室敏感株1个个体的ace1基因的编码区相差了24个碱基,导致所编码的成熟蛋白在44~51氨基酸残基处缺失了8个氨基酸。经过在昆虫杆状病毒表达系统中的表达,推测这段基因的可变剪接可影响乙酰胆碱酯酶的活性。     

口蹄疫感染与免疫动物鉴别诊断方法的建立

目的 建立鉴别自然感染口蹄疫动物和口蹄疫灭活疫苗免疫动物的诊断方法.方法 构建重组杆状病毒的转座质粒pFastBac-3AB,转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3AB;将Bacmid-3AB转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒.以重组杆状病毒表达的3AB蛋白为抗原建立鉴别口蹄疫感染与免疫动物的ELISA诊断方法,并对各种反应条件进行优化,包括抗原包被时间、包被浓度、封闭剂、酶标抗体工作浓度等.结果 获得了重组杆状病毒,成功表达了口蹄疫病毒3AB蛋白,并用纯化的3AB蛋白建立了检测口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法.用该方法检测FMDV感染动物和免疫动物血清抗3AB蛋白抗体,猪和牛感染血清检测的阳性率分别为83.3%和91.7%.结论 用纯化的口蹄疫病毒3AB蛋白建立了鉴别诊断口蹄疫感染与免疫动物的ELISA诊断方法.     

杆状病毒表达载体系统的特点及其在寄生虫学上的应用

杆状病毒载体表达系统使用一个或多个启动子 ,将外源目的基因插入到启动子下游 ,获得重组病毒 ,这种重组病毒在昆虫细胞或虫体内复制的同时 ,使外源基因得到表达。随着杆状病毒分子生物学和表达载体研究的不断深入 ,作为真核表达载体 ,该系统区别于其他表达系统的特点更为突出 ,主要表现在目的基因容量、表达效率、目的蛋白活性、可操作性、生物安全性和在寄生虫学上的应用等     

杆状病毒/哺乳动物基因转移载体应用于活载体疫苗研究的进展

近年,高致病性禽流感、猪链球菌等动物疫病频繁暴发流行,不但对畜牧业生产造成巨大经济损失,而且给人民健康带来严重威胁。因此,如何研制并利用安全、有效的基因工程疫苗对预防和控制人兽共患传染病的发生和流行意义重大。     

人乳头状瘤病毒18型阳性肿瘤疫苗的构建及体外活性鉴定

目的: 制备人乳头状瘤病毒（human papilloma virus, HPV）18型阳性的肿瘤疫苗，并观察其体外活性。方法:利用昆虫杆状病毒(简称Bac to Bac)表达系统，将HPV18L1基因重组入穿梭质粒pFastBacHtb，构建HPV18 L1Htb，通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因