重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究

目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定。结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达。结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础。     

HSP27和BIRC6的表达与大肠癌预后的关系

目的探讨HSP27和BIRC6在大肠癌中的表达及其与预后的关系。方法收集182例临床预后资料完整的大肠癌标本,用免疫组化染色HSP27和BIRC6抗体,观察HSP27和BIRC6表达情况。采用X^2和Spearman等级相关检验,研究大肠癌HSP27和BIRC6的表达率与临床病理特征的关系。生存曲线采用Kaplan—Meier生存分析方法。通过多因素Cox比例风险模型分析各变量对生存期的影响。结果研究发现,大肠癌组织中HSP27表达率为79．7％（145／182）;而BIRC6表达率较低,为47．3％（86／182）。单因素分析显示HSP27的表达率与肿瘤的TNM分期相关（P〈0．05）,提示HSP27低表达的大肠癌患者生存期长于高表达患者。BIRC6的表达率与肿瘤的TNM分期、分化程度相关（P〈0．05）,提示BIRC6高表达的大肠癌患者生存期长于低表达患者。多因素分析显示HSP27为大肠癌预后的独立预测因素,而BIRC6作为判断大肠癌预后的预测价值有限。结论本研究提示,HSP27对大肠癌的预后具有潜在的预测价佰,而BIRC6表诀水平作为判断大肠癞预后的预测价佰右限．     

hGITRL_(aa52-177)蛋白在杆状病毒系统中的表达

目的 利用杆状病毒系统表达hGITRLaa52-177蛋白.方法 PCR扩增获得hGITRL胞外段(hGITRLaa52-177)基因,克隆入pFastBacHTa转移载体,在E.coli DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,得到重组杆粒,转染Tn细胞表达目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定目的蛋白的表达.结果 重组载体 pFastBacHTa-hGITRLaa52-177以及重组杆粒Bacmid-hGITRLaa52-177构建正确,在Tn细胞内成功表达6×His-hGITRLaa52-177重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting显示重组hGITRLaa52-177蛋白相对分子质量约为Mr 18 000.结论 杆状病毒-昆虫表达系统获得 hGITRLaa52-177蛋白,为进一步从蛋白质水平研究hGITR/hGITRL对机体免疫调节的影响奠定了基础.     

SETD4蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统的表达

目的　通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4（SET domain-containing 4）蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。 方法　提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至pFastBac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。 结果　经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 kD处可检测到目的条带。 结论　成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。     

亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因在昆虫细胞中的共表达

目的在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和疫苗奠定基础。方法从质粒pTOP-P1-2A和pTOP-3C中分别扩增出编码亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和3C蛋白酶基因,构建转移载体pDual-P1-2A-3C并与大肠杆菌(Escherichia coli)DH10Bac中的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-P1-3C。在脂质体介导下将rBacmid-P1-3C转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在Sf9昆虫细胞中共表达P1-2A和3C蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和Dot-ELISA试验鉴定重组蛋白。结果目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达蛋白与抗亚洲1型FMDV血清发生特异性反应,有良好的抗原性。结论成功在昆虫细胞中表达亚洲1型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因。     

真核蛋白表面展示系统

酵母表面展示和杆状病毒表面展示是近年来发展起来的新的蛋白表面展示技术,可用于展示需糖基化作用、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白。本文简述了该技术的基本原理、应用、研究进展及其发展前景。     

抗癌胚抗原微型抗体基因在昆虫细胞中的表达

目的获得生物活性更高的癌胚抗原(CEA)微型抗体用于放免显像。方法将抗癌胚抗原微型抗体基因插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTb中,经大肠杆菌DH10Bac体内转座,产生重组杆状病毒BacHT-VH-L,将其转染粉纹夜蛾(Tn-5B1-4)细胞,经扩增后在细胞内进行表达。结果SDS-PAGE分析结果表明,在Tn-5B1-4细胞中表达产生一条特异性蛋白质,其分子量为26kd左右;以Westem blot分析表明,该特异条带即为VH-L蛋白。RIA表明重组杆状病毒表达产生的VH-L蛋白能特异性的结合CEA,较大肠杆菌表达物活性更高。结论昆虫细胞表达可制备生物活性更高的癌胚抗原微型抗体。     

OPCML基因在杆状病毒—昆虫细胞表达系统中的表达

目的：利用杆状病毒表达系统行OPCML基因在Sf9昆虫细胞中表达。方法：以OPCML-PWPI为模板,利用PCR方法扩增OPCML基因,将OPCML基因连接到PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经Western-blot检测表达产物。结果：OPCML-PACGp67A质粒转染Sf9细胞后,在相对分子质量约37 000处有一条新生蛋白带经检测为OPCML蛋白。结论：OPCML基因成功在Sf9细胞中得到表达。     

昆虫细胞杆状病毒表达系统表达重组人类ZP3蛋白的研究

目的:探讨利用重组表达系统制备重组人类ZP3(h ZP3)蛋白的方法和技术难点,为h ZP3蛋白的制备和应用打下技术基础。方法:构建h ZP3的载体质粒p FASTBAC HTa-h ZP3,在大肠杆菌宿主细胞中利用杆状病毒Bac-to-Bac系统同源重组构建重组的杆状病毒穿梭载体Bacmid,用重组的Bacmid转染Sf9细胞制备重组杆状病毒,分别表达带HIS标签的h ZP3全长蛋白(氨基酸1~424)和截短的h ZP3蛋白(氨基酸23~348)。摸索重组h ZP3蛋白的表达时间和纯化制备方法。结果:成功制备了表达重组人h ZP3全长蛋白和截短体蛋白的Bacmid和杆状病毒颗粒,Western印迹检测表明,在Sf9细胞中较好的表达时间段为感染后72~96 h。重组表达的h ZP3蛋白可以部分被钴柱亲和纯化,大量的重组h ZP3蛋白不能结合到亲和介质而流穿,但确切的原因还未知。纯化得到的h ZP3经荧光素Dylight Dye488标记,能与人精子结合。结论:利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达h ZP3蛋白是可行的,可以进一步优化,但h ZP3蛋白的有效富集和纯化方法是最大的瓶颈,还需要进一步摸索。     

利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。