重组人Versican G1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的：利用杆状病毒．昆虫细胞表达系统制备人蛋白聚糖Versican G1区(VG1)的重组蛋白。方法：将编码人VG1蛋白343个氨基酸的基因插入pFastBacl载体，转化大肠杆菌DH10Bac，提取重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞，获取含重组人VG1蛋白的杆状病毒进一步感染昆虫细胞进行蛋白表达。通过Ni—NTA层析柱对重组蛋白进行纯化。免疫印迹方法对昆虫细胞培养上清中的蛋白成分进行鉴定，采用透明质酸结合实验确定重组人VG1蛋白的生物活性。结果：人VG1基因在昆虫细胞中获得高水平表达，重组人VG1蛋白具免疫原性和与透明质酸结合的生物活性。结论：昆虫细胞表达的重组人VG1蛋白具有良好的免疫原性和生物活性。     

人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达

目的：分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因K12，克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法：设计一对引物，在引物的5’端分别引入。BamH1、EcoRI酶切位点，以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV～8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVLl393中，构建成重组K12杆状病毒转移载体pVL-K12，并与线性：BaculoGold病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平；间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果：含HHV-K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达，经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论：杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。     

以Bacmid-杆状病毒系统表达人CTLA4胞外区蛋白的研究

目的 在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中表达人CTLA4。方法 采用PCR技术，自pUC19-CTLA4Ig质粒中获取人CTLA4胞外区cDNA，将其克隆人pFastBacl质粒中，经DNA自动测序仪进行DNA序列鉴定，并进一步将其转座人Bacmid中，在昆虫细胞HzAM1中进行表达，采用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果 在昆虫细胞表达系统中表达出完全糖基化的人CTLA4胞外区重组蛋白。结论 人CTLA4胞外区cDNA在Bacmid-杆状病毒，昆虫细胞系统中得到了表达。     

鲑鱼降钙素重组杆状病毒载体的构建及表达

目的：利用昆虫细胞杆状病毒系统表达重组鲑鱼降钙素（recombinant salmon Calcitonin，rsCT），探索一条真核生物表达生物活性rsCT的新途径。方法：将鲑鱼降钙素基因重组到pFastBac杆状病毒穿梭载体（baculovirus shuttle vector，Bacmid）中，构建重组鲑鱼降钙素杆状病毒表达载体即重组鲑鱼降钙素Bacmid，后将其转染昆虫细胞Sf9，表达目的蛋白，并对表达产物进行分子量及免疫反应性鉴定。结论：证实目的基因在昆虫细胞中获得了表达。结论：成功构建了鲑鱼降钙素重组杆状病毒载体并在昆虫细胞中初步表达。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定北大核心CSCD

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

杆状病毒载体介导钠碘转运体基因放射治疗肝癌的实验研究

目的 探讨以杆状病毒为载体、钠碘转运体(NIS)基因介导131I放射治疗肝细胞癌的可行性.方法 通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组的绿色荧光蛋白(GFP)和NIS基因杆状病毒(Bac-GFP和Bac-NIS).采用流式细胞仪检测在有无丁酸钠条件下HepG2细胞的感染效率和荧光表达强度,以及在高感染复数(Mol)杆状病毒条件下对HepG2细胞的毒性.进行Bac-NIS 感染HepG2细胞的动态摄碘实验和高氯酸钠(NaClO4)摄碘抑制实验,以及Bac-NIS感染HepG2细胞的131I杀伤细胞克隆形成实验.结果HepG2的感染效率和荧光强度随着Bac-GFP MOI的增加而增加,Bac-GFP对HepG2具有较高的感染效率(MOI=200时,感染效率为65％),丁酸钠可进一步提高HepG2的感染效率.在高MOI(MOI=400)条件下,未见Bac-GFP对HepG2的细胞毒性作用,与对照组(MOI=0)比较差异无统计学意义(P＞0.05).Bac-NIS感染的HepG2细胞表现出摄碘功能和NaCIO4抑制的特性.细胞克隆形成实验表明,Bac-NIS感染的HepG2细胞克隆存活率明显低于Bac-GFP感染的HepG2细胞,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Bac-NIS可有效介导肝癌细胞的碘摄取,高效杀伤肿瘤细胞,为肝癌细胞的靶向基因放射治疗提供了实验基础.     

杆状病毒表达系统的研究与应用进展

杆状病毒是昆虫专一性的病原病毒,杆状病毒表达系统是当今基因工程四大表达系统之一。本文对杆状病毒表达系统构成元素（转移载体、亲本病毒和重组介质）的发展以及应用作了详细的论述,其应用一是在农业生产中开发作为生物杀虫剂,二是生物分子基础研究中重组蛋白的表达,三是医学研究中的基因治疗、疫苗开发和药物筛选。     

利用家蚕病毒颗粒表达和纯化抗肿瘤药物天冬酰胺酶

目的：通过家蚕病毒颗粒简化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶的生产纯化过程,为抗肿瘤的药物生产提供依据。方法：利用基因重组技术构建pFastdual-polh-da26-asp融合蛋白真核表达载体,利用杆状病毒表达系统在家蚕细胞中表达融合蛋白,奈氏试剂法检测L-天冬酰胺酶活性。结果： 成功构建了重组表达载体,融合蛋白在家蚕细胞中顺利表达,并检测到L-天冬酰胺酶在家蚕细胞中表达,活性为2 113.52 U/mg。结论：重组病毒颗粒成功表达,且L-天冬酰胺酶具有一定的活性;可以利用家蚕颗粒病毒简化纯化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶。     

杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1 siRNA对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的: 观察杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1) siRNA(小干扰RNA)对人胰腺癌PaTu8988细胞凋亡的影响。方法： 人胰腺癌细胞PaTu8988用6孔板培养并随机分成5组：空白组、阴性组、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)、r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组)。空白组仅加10%胎牛血清和DMEM培养基培养,阴性组、D1组、D2组、D3组加血清和DMEM培养基培养24 h后,分别加入空白载体r-Bac-CMV-EGFP和重组杆状病毒r-Bac-si-DNMT1-D1、r-Bac-si-DNMT1-D2、r-Bac-si-DNMT1-D3, 150 μL/孔。72 h后收集5组细胞,用流式细胞术测肿瘤细胞凋亡,蛋白质印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达情况。结果：D1组、D2组和D3组的细胞凋亡率明显高于空白组和阴性组(P<0.05)。与空白组和阴性组相比,D1组、D2组和D3组Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论： 杆状病毒介导的DNMT1 siRNA通过抑制Bcl-2蛋白表达,增加Bax蛋白表达,诱导胰腺癌细胞的凋亡。     

重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究

目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定。结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达。结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础。