杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达

目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFkB)启动子和增强子序列,并插入AcMNPV中,用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒,分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞,测定CAT表达相对活性。结果 由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT,而NFkB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低,而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论 重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因,而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。     

CEA CTL-Th融合表位疫苗的优化设计及其重组杆状病毒表达载体的构建

目的:构建CEACTL Th融合表位疫苗(以HPV16L1为蛋白载体)的重组杆状病毒表达载体,探索开发新型高效CEA疫苗的新途径。方法:应用PCR技术从质粒114KL1pFastBac1中扩增HPV16L1片段,并连入T载体(pMD18T);通过酶切和连接将HPV16L1片段和CEA PADRE可退火引物克隆至杆状病毒转移质粒pFastBac1的相应酶切位点;最终通过转座效应得到融合表位疫苗的重组杆状病毒表达载体。结果:重组子通过测序和PCR等方法分别得到验证。结论:成功构建了CEA融合表位疫苗的重组杆状病毒表达载体。     

杆状病毒表达系统在疫苗研究中的应用

目前使用的体外基因表达系统有多种。各有其优缺点。常用的大肠杆菌原核表达系统操作方便，表达稳定。但表达基因的分子量有限，不能对表达产物进行翻译后修饰。动物细胞表达具有良好的翻译后修饰功能，但成本高，操作复杂。杆状病毒表达系统是近年来日益受到重视的又一个重要的表达系统。现介绍如下。     

人T细胞受体ζ链基因在昆虫细胞中的表达

目的：克隆人T细胞受体 (TCR) ζ链基因，运用昆虫杆状病毒系统表达该蛋白。方法：用RTPCR从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆TCR ζ链cDNA，构建到昆虫杆状病毒系统专用的Transfer载体中，并与杆状病毒共转染昆虫sf 9细胞。用SDSPAGE电泳和用小鼠抗人ζ链蛋白的单抗在流式细胞仪中鉴定重组蛋白的表达。结果：克隆的人TCR ζ链cDNA插入昆虫杆状病毒载体，并在昆虫sf 9细胞中特异地表达了蛋白。表达量约为细胞裂解上清液总蛋白的11%。经SDSPAGE分析，其分子量大小与预期的重组ζ链蛋白一致。用胞内标记流式细胞仪检测证实，转染重组杆状病毒的昆虫细胞含有人的ζ链蛋白。结论： 从人PBMC中成功克隆了T细胞受体ζ链的基因，并在昆虫细胞中获得高效表达。用生物工程技术获得TCR ζ链蛋白有利于深入研究其生物学功能     

大肠癌新型CEA疫苗重组杆状病毒的表达与鉴定

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建新型CEA融合表位疫苗(以HPV16L1为蛋白载体)的重组杆状病毒.方法构建含有HPV16L1片段和CEA-PADRE合成片段的表达载体pFastBacl-Ⅴ,转化DH1OBac感受态菌.利用其含有的细菌Tn7转座系统,将该基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中,转染昆虫细胞sf9,获得新型CEA疫苗的重组杆状病毒.结果限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明目的片断正确克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中;重组杆状病毒感染昆虫细胞后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段.结论利用杆状病毒表达系统,成功构建了CEA融合表位疫苗的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础.     

杆状病毒表达载体的构建及其在疫苗研究中的应用

杆状病毒表达载体已构建成功,成为疫苗研制中的一个有利的工具。本文介绍了杆状病毒表达载体的构建及其在疫苗研究中的应用。     

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ－杆状病毒－昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ－９。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ－９全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲ＾ＴＭⅡ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ－１真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ－９ｃＤＮＡ定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ中,在昆虫细胞Ｓｆ９中进行表达,采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对表达产物进行分析。     

抗汉滩病毒双链抗体重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达

目的应用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统构建具有抗汉滩病毒(HTNV)G2糖蛋白(GP)鼠源性mAb 3G1与抗HTNV核蛋白(NP)鼠源性mAb 1A8嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达抗HTNV双链抗体并对表达产物进行初步鉴定。方法构建含有嵌合基因的杆状病毒表达载体ScFv-pFBD-ScFv‘,转化DH10Bac致敏菌,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上,快速筛选出含有抗HTNV双链抗体嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中进行表达,并利用间接免疫荧光试验检测表达产物。结果构建了含抗HTNV双链抗体嵌合基因之重组杆状病毒,并在昆虫细胞中表达出特异性抗体,该抗体能被兔抗人Q抗体所识别并可与HTNV NP和GP特异性结合。结论成功地在昆虫细胞中表达出抗HTNV双链抗体,且该抗体具有与HTNV NP抗原和GP抗原结合的活性。     

EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化

目的 应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸（6 X His）的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论 利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.     

柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒免疫原性的初步研究

目的 研究柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CA16）病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）的免疫原性.方法 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统共表达3CD及P1蛋白,制备CA16病毒样颗粒,通过SDS-PAGE及透射电镜等方法对VLPs进行鉴定,以氢氧化铝佐剂免疫ICR小鼠,并对乳鼠经颅腔攻毒.对病毒样颗粒疫苗的免疫原性及保护效果进行评价.结果 将重组CA163CD及P1蛋白的杆状病毒转染SF9细胞,可以产生类似CA16病毒颗粒的大小为27 ～ 30 nm的VLPs.小鼠免疫试验结果显示CA16 VLPs可以刺激产生较高水平的抗CA16病毒的特异性IgG抗体及中和抗体,乳鼠攻毒试验结果显示,母传抗体保护率高达90％.结论 CA16 VLPs可以刺激小鼠产生较高水平的体液免疫反应,并且母传抗体可以保护乳鼠抵御经颅腔的病毒攻击.