靶向性蛋白激酶B1和环氧合酶-2 shRNA腺病毒载体的构建和在人胃癌细胞的表达

Objective To construct a short hairpin RNA (shRNA) adenovirus vector targeting protein kinase BI (PKB1/Akt1) and cyclooxygenase-2 (COX-2) and observe their expression in human gastric carcinoma cell line SGC-7901. Methods Akt1 and COX-2 shRNA expression frames were sub-cloned to pGSadeno adenovirus vector by homologous recombination technology to construct pGSadeno-Aktl + COX-2 ( pGSadeno-A + C) vector. Furthermore after screening and amplification,recombinant ade-novirus vector was digested with Pacl and transfected into HEK293 cells. The replication adenovirus rAd5-A + C was packed and amplified in the HEK293 cells, and its titer was detected. After human SGC-7901 cells in vitro were transfected by rAd5-A + C,Akt1 and COX-2 mRNA and protein expression levels were detected by real-time PCR and Western blot respectively. Compared with rAdS-A + C,SGC-7901 and gen-eral rAd5-HK were selected as the negative controls. Results The recombinant adenovirus rAd5-A + C was constructed successfully and its titer reached 1.0 ×1010 pfu/ml. Aktl and COX-2 mRNA expression was downregulated significantly, and their ACt values ( 12.26±0.05 and 5.41±0.09 respectively ) were higher than rAd5-HK group (10.63±0.02 and 3.75 +0.08 respectively) and control group (10.57± 0.02 and 3.73±0.08 respectively) (P <0.01 ). There was no significant difference between rAd5-HK and control groups (P >0.05). Aktl and COX-2 protein expression was downregulated by 70.5% and 63.7% respectively ( P < 0.01 ) in rAd5-HK group as compared with control group ( P > 0.05 ). Conclu-sion The shRNA aclenovirus vector targeting Akt1 and COX-2 can specifically inhibit Akt1 and COX-2 expression,and this may be a new strategy in gastric carcinoma gene therapy targeting Akt1 and COX-2.     

恶性疟原虫RNA组分的分离

恶性疟原虫ＲＮＡ组分的分离南京军区福州总医院检验中心第一军医大学疟疾免疫研究室福州３５０００１兰风华，林来兴妹，赵雨田，毕惠祥，彭一兵，李英杰为了研究恶性疟原虫的ＲＮＡ，综合文献报道的多种方法，建立了从同批虫体中分离多个不同ＲＮＡ组分的方法，效果良好...     

卵巢肿瘤细胞DNA及RNA含量的定量分析及其临床意义

本资料对９３例不同性质的卵巢肿瘤细胞ＤＮＡ及ＲＮＡ含量进行了定量研究，其中５０例良性、４３例恶性。并对患者进行１～５年的随访。结果是卵巢良性肿瘤的异倍率（假阳性）为４４％，恶性肿瘤异倍率为８６．０％。以“标准ＤＩ”及“标准ＲＩ”为指标判断卵巢肿瘤性质的准确率较以“异倍性”为高，且双指标同时应用高于任一单指标：对卵巢良恶性肿瘤的诊断准确率分别为９０％和９５．３％。提出“标准ＤＩ”和“标准ＲＩ”是判断卵巢肿瘤性质的理想指标。且ＤＮＡ及ＲＮＡ含量与卵巢癌预后有密切关系。     

基因功能研究策略

美国塞莱拉遗传信息公司通过人类基因组计划，于2001年在美国《科学》杂志和英国《自然》杂志上联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因组图谱。基因组计划完成后，新的难题摆在了科学家的面前，那就是基因功能的研究以及怎样提高基因功能研究的效率等问题。对于一种基因，阐明基因的结构与生物学功能、基因的结构与生物学和临床医学之间的相互关系以及新基因表达调节的机制，是目前基因的分子生物学研究领域中最具挑战性的工作。当前主要采用以下技术。     

PCBP1:一种在多水平上参与基因表达调控的蛋白因子

多聚胞嘧啶结合蛋白1 (poly C binding protein-1,PCBP1),属于RNA结合蛋白亚家族,因其具有同RNA的多聚胞嘧啶(poly C)区域特异的结合活性而得名.目前该亚家族共有5个成员:hnRNP K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)、PCBP1、PCBP2、PCBP3和PCBP4.PCBP1蛋白在多个水平参与基因的表达调控,如转录、mRNA加工、mRNA的转运、mRNA稳定以及翻译水平调控等.本文对PCBP1基因的结构和生物学功能进行了综述.     

逆转录病毒介导的c-met-小干扰RNA抑制肝癌转移的体内研究

我们对c-met与肝癌的临床病理因素的关系进行了分析，明确了c-met与肝癌转移有关联。此前也通过逆转录病毒载体介导，成功建立了表达c-met-siRNA的肝癌细胞株MHCC97-H／c-met-siRNA，并证实逆转录病毒载体能长期、稳定表达针对靶基因c-met的siRNA，因此，本研究拟进一步在体内研究c-met-siRNA对肝癌生长、转移的影响，以期为c-met-siRNA应用于临床防治肝癌转移复发提供实验依据。     

保罗样激酶基因沉默体外抑制胶质瘤细胞侵袭与生长

目的观察保罗样激酶1基因(plk1)沉默对胶质瘤细胞株-H4体外生长的抑制作用,探讨plk1基因作为胶质瘤治疗靶点的可行性。方法化学合成小片断干扰RNA(siRNA)抑制plk1基因的表达,Western blot检测plk1蛋白质的表达变化,流式细胞仪检测H4细胞周期分布及凋亡程度的变化,体外侵袭实验检测H4细胞侵袭能力的变化,MTT法检测H4细胞增殖速度的变化。结果经siRNA作用48h后,plk1蛋白质水平明显降低;较多的H4细胞聚集于G2/M期附近(P<0.05);细胞凋亡明显上升(P<0.05);细胞体外侵袭能力下降(P<0.05);增殖速度明显缓于对照组(P< 0.05)。结论靶向plk1的siRNA可在体外抑制胶质瘤细胞H4的侵袭与增殖,plk1有可能成为新的潜在胶质瘤治疗靶点。     

短发卡RNA对人胃癌细胞STAT3基因的沉默作用

目的:探讨STAT3基因小发夹RNA（shRNA）表达质粒对胃癌MKN-45细胞STAT3基因的干扰作用。方法:根据STAT3 mRNA 编码序列，设计RNA干扰靶点，构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒（psiRNA-H1/STAT3），使用脂质体转染人胃癌细胞系（MKN-45细胞）。实验分为对照（A）组，psiRNA-H1转染（B）组和psiRNA-H1/STAT3转染（C）组。通过RT-PCR和Western Blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达的影响。结果:psiRNA-H1/STAT3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确，并经测序证实。将其成功转染MKN-45细胞后，该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。 结论:将成功构建的针对STAT3基因的shRNA表达载体转染MKN-45细胞，能有效抑制该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达，为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。     

沉默树突状细胞恒定链以增强其抗肿瘤作用的体外实验研究

目的初步观察用小分子干扰RNA(siRNA)沉默树突状细胞(DCs)恒定链(Ii)后,DCs疫苗的体外抗肿瘤效果。方法从小鼠骨髓分离骨髓前体细胞,细胞经100 ng/ml GM-CSF和100 ng/ml IL-4诱导培养6 d后,转染针对DCs Ii链特异的Ii-siRNA,转染后加用50 ng/ml TNF-α继续诱导细胞成熟48 h,然后分别用Western blot检测沉默效果及CCK-8试剂盒检测DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;此外,DCs共转染Ii-siRNA和小鼠胃癌前体细胞MFC的总RNA后,与同种异体淋巴细胞共培养,通过ELISA检测培养上清IFN-γ/和IL-4的水平,并收集致敏淋巴细胞进行体外杀伤实验。结果Ii-siRNA明显抑制DCs Ii的表达。沉默Ii链能够增强DCs的淋巴细胞增殖能力,并促使淋巴细胞向Th1的方向漂移[IFN-γ:(5107±351)pg/ml,IL-4:(65±13)pg/ml,P＜0．05]。淋巴细胞经共转染Ii-siRNA和MFC RNA的DCs激活后,明显而特异地杀伤靶肿瘤细胞(杀伤百分率: 66．94%±2．75%,P＜0．05)。结论通过siRNA沉默DCs的Ii链可能是一种行之有效的增强抗肿瘤免疫的方法。     

乙型肝炎治疗研究进展

乙性肝炎病毒感染所导致的慢性肝炎是我国的一个大问题,给患者及社会带来了很大负担。慢性乙型肝炎现行治疗主要依靠干扰素、核苷类似物等,其存在高耐药、低耐受以及不良反应等问题。新的、更为安全有效的治疗药物及方法亟待发展。最近,科学家们发现人体内的TRIM22分子对抑制乙肝病毒的复制起到重要作用,为乙肝的治疗及有效药物的研发开辟了新的道路。