α亚麻酸对体外成熟人卵母细胞线粒体DNA拷贝数的影响

目的：探讨α亚麻酸（ALA）对人未成熟卵母细胞体外成熟的影响及对卵母细胞线粒体DNA拷贝数的影响。方法：收集2014年10月—2015年10月因男方因素行胞浆内单精子注射（ICSI）的273例患者的未成熟卵母细胞441枚,其中MⅠ期179枚,GⅤ期262枚。将MⅠ期和GⅤ期卵母细胞按相同的构成比随机分为5组,分别放入含不同浓度[0（对照组）,10 μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L,200 μmol/L]ALA的培养液中,培养24 h后观察卵母细胞的成熟情况,实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）测定各组卵母细胞的线粒体DNA（mtDNA）拷贝数。结果：①各组未成熟卵母细胞体外成熟培养（IVM）后总成熟率以ALA 50 μmol/L组（70.1%）最高,明显高于对照组（42.1%）及ALA 200 μmol/L组（34.1%）,差异有统计学意义（P＜0.05）;②5组GⅤ期卵母细胞成熟率以ALA 50 μmol/L组（64.4%）最高,明显高于对照组（28.9%）及ALA 200 μmol/L组（18.2%）,差异有统计学意义（P＜0.05）;③ALA 50 μmol/L组成熟卵母细胞mtDNA拷贝数（3.64×107±1.85×106）大于对照组（3.42×106±1.95×105）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：50 μmol/L ALA在体外实验中可增加卵母细胞mtDNA拷贝数,有促进人未成熟卵母细胞体外成熟的作用。     

玻璃化冷冻的卵母细胞在卵母细胞捐赠中的应用

目的：分析玻璃化冷冻的卵母细胞在供卵周期中的临床结局,以期为卵母细胞捐献的临床应用提供参考。方法：回顾性分析2006年2月—2014年10月南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心216个供卵周期的玻璃化冷冻的卵母细胞,比较解冻后的复苏率、行体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）的正常受精率、累计临床妊娠率、种植率和累计活产率等临床结局。结果：解冻玻璃化冻存的卵母细胞的复苏率为82.0% （899/1 097）,二原核（2PN）受精率76.9%（691/899）。在216个周期中,胚胎种植率为21.4% （84/393）,累计临床妊娠率为33.3% （72/216）,累计活产率达27.3%（59/216）。每解冻1枚卵母细胞获得活产儿的概率为6.5%（71/1 097）。结论：卵母细胞玻璃化冻融技术在卵母细胞捐赠的临床应用上可以获得较好的临床结局。     

钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活行卵母细胞质内单精子注射后未受精卵母细胞的研究

目的观察钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞质内单精子注射（ICSI）后未受精卵母细胞的激活作用。方法将体外成熟（IVM）-ICSI和常规ICSI后未受精卵母细胞,按行ICSI后体外培养的时间,分为IVM-ICSI 22h组（33个）、IVM—ICSI 44h组（18个）、ICSI44h组（37个）、ICSI68h组（25个）,分别采用钙离子载体A23187联合嘌呤霉素进行激活处理。应用荧光原位杂交（FISH）技术,对来源于双原核合并第二极体合子的激活胚胎进行性染色体分析。结果钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能激活行ICSI后22—68h未受精的卵母细胞。其中IVM-ICSI22h组卵母细胞激活率为88％（29／33）、总卵裂率为62％（18／29）、4细胞阶段胚胎发育率为28％（5／18）,1个胚胎发育到桑椹胚阶段;而IVM-ICSI44h组、ICSI44h组、ICSI68h组的未受精卵母细胞激活率分别为56％（10／18）、65％（24／37）、52％（13／25）;总卵裂率分别为20％（2／10）、42％（10／24）、46％（6／13）,仅ICSI44h组有1个胚胎发育到4细胞阶段。FISH对激活胚胎的分析显示,4个胚胎为XX,9个胚胎为XY。结论钙离子裁体A23187联合嘌呤霉素能有效激活行ICSI失败的卵母细胞;行ICSI后22h内,是对未受精卵母细胞进行辅助激活较为理想的时机。激活的双原核合并第二极体胚胎中有雄原核的存在。     

采用新鲜和冻融精子进行卵母细胞胞质内单精子注射的临床效果比较

目的 比较采用新鲜和冻融的睾丸及附睾精子进行卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)的临床效果.方法 选择2006年9月-2007年5月因无精症于北京大学第三医院生殖医学中心行ICSI的患者208例,按患者意愿分为冻融组37例和新鲜组171例.冻融组在行ICSI前将冻存的睾丸或附睾精子解冻并复苏.观察冻融组睾丸和附睾精子的临床利用率;比较两组患者的临床结局(包括正常受精率、优质胚胎率、临床妊娠率及胚胎着床率等)和妊娠结局(包括流产率、分娩孕周及新生儿出生体重等).结果 (1)冻融组睾丸精子的临床利用率为92%(23/25),附睾精子为100%(12/12).(2)新鲜组患者的正常受精率、优质胚胎率、临床妊娠率及胚胎着床率分别为62.25%(973/1563)、78.9%(768/973)、44.4%(60/135)和29.3%(84/287),分别与冻融组[分别为64.53%(282/437)、79.1%(223/282)、46.9%(15/32)和33.3%(23/69)]比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).(3)新鲜组患者的流产率、单胎妊娠分娩孕周、双胎妊娠分娩孕周、单胎妊娠平均新生儿出生体重及双胎妊娠平均新生儿出生体重分别为11%(6/55)、(39.0±1.4)周、(36.8±1.7)周、(3409±393)g和(2584±266)g,分别与冻融组[分别为7%(1/15)、(38.7±0.6)周、(36.3±1.2)周、(3350±383)g和(2635±171)g]比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 采用冻融的睾丸或附睾精子行ICSI安全、有效,值得在临床推广.     

线粒体功能障碍与卵巢衰老

线粒体是细胞中能量的供给中心,其功能异常可导致细胞衰老尤其是卵巢的衰老。线粒体是卵母细胞中最重要的细胞器之一,是母体在早期胚胎形成过程中最主要的贡献之一。线粒体功能障碍被视为减数分裂染色体不分离以及胚胎有丝分裂出错的最主要原因,且与卵母细胞质量和胚胎发育潜能下降有密切关系。卵母细胞质量降低表现为减数分裂时期纺锤体的异常、染色体排列错误、端粒缩短以及黏连蛋白缺失,这些因素会增加非整倍体卵母细胞的产生并导致不孕。线粒体DNA（mtDNA）拷贝数可以作为预测卵母细胞质量及胚胎发育潜能的生物学指标,自体同源线粒体移植以及线粒体营养物质的使用可以作为卵巢功能减退及低反应患者的治疗选择。     

The use of anti-Müllerian hormone and antral follicle count to predict the potential of oocytes and embryos

Objective

To investigate whether anti-Müllerian hormone (AMH) is better than antral follicle count (AFC) in predicting oocyte yield and embryo quality after controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization (IVF).

Study design

This is a prospective observational study involving 162 women (<40 years old) undergoing their first IVF cycle at an IVF unit within a university hospital. AMH and AFC measurements were made on day 3 of the cycle within 3 months of starting ovarian stimulation. A standard long down-regulation protocol using gonadotrophin releasing hormone agonist and recombinant follicle stimulating hormone was used. A maximum of two embryos were transferred on day 2 or 3 following oocyte retrieval. The primary outcome was the number of good quality embryos available for transfer and freezing. Embryos were graded according to the number of blastomeres, the difference in blastomere size and the degree of fragmentation, into grades 1–4. Secondary outcomes included the number of oocytes retrieved and fertilized and the live birth rate. Correlation between different parameters was calculated using Spearman's correlation coefficient. Receiver operating characteristic (ROC) curves were generated for AMH and AFC to compare ability of parameters to predict top quality or frozen embryos and the occurrence of a live birth.

Results

Of the 137 women who had fresh embryo transfer, 52 became pregnant (32.1% pregnancy rate per cycle started) and 38 had a live birth (23.5% live birth rate per cycle started). Both AMH and AFC had highly significant correlations with the number of oocytes retrieved and the number of oocytes fertilized (P < 0.001). The two markers were also significantly associated with the number of top quality embryos available for transfer and the number of embryos frozen (P < 0.01). With regard to live birth, AMH performed better than AFC (P < 0.01 and P < 0.05, respectively), but both markers were more valuable in predicting the absence rather than the occurrence of live birth (negative predictive value 84%).

Conclusions

AMH and AFC are comparable predictors of oocytes retrieved and of the number of good quality embryos available for transfer and freezing. Prediction of live birth may help clinicians selecting patients suitable for single embryo transfer.     

被动吸烟对雌性小鼠生殖功能的影响

为了探索被动吸烟对生殖功能的影响。采用体内实验和卵母细胞体外培养、体外受精的方法 ,研究被动吸烟对小鼠生殖力的影响。结果 :被动吸烟可以显著降低小鼠的妊娠率 ,抑制胚胎发育和卵母细胞的体内成熟 ,降低第一极体的释放率和卵母细胞的体外受精率 ,使卵母细胞的质量和存活率显著降低 ,影响卵巢与体重比例 ,但对生发泡破裂无影响。实验结果还显示 ,停止被动吸烟和将卵母细胞以及受精卵培养在正常培养液中 ,小鼠的生殖能力又能基本恢复 ,卵母细胞的第一极体的释放率以及体外受精率都明显提高。结论 :被动吸烟可以抑制卵母细胞的成熟 ,降低小鼠的生殖能力 ,香烟烟雾中的某些成分被育龄妇女吸收后 ,会导致生殖能力下降 ,甚至导致不孕 ,但香烟烟雾的这种毒性作用可能是短暂的、可逆的。     

孕期限食对子代生长发育及卵母细胞印记基因H19甲基化的影响

目的 建立孕期限食的小鼠模型,探究宫内营养不良对子代生长发育及卵母细胞印记基因H19甲基化水平的影响。方法 正常交配见栓的雌鼠随机分为实验组和对照组,d_0.5~d_12.5监测孕鼠每日消耗食物量。实验组小鼠自d_12.5到分娩,给予日常消耗食量的一半食物量,对照组不做任何处理。两组孕鼠在分娩后给予正常食物量。观测子代小鼠的出生数量、出生体重、性别比,同时监测子代小鼠在不同生长时期的体重。子代小鼠性成熟后,取雌鼠的卵母细胞,检测印记基因H19的甲基化水平。结果 （1）孕期限食的母鼠状态差,体型偏小,活动量极少,个别孕鼠在分娩前死亡,早产发生率明显增加（P<0.05）。（2）限食孕鼠的子代小鼠出生体重明显低于正常孕鼠的子代（P<0.05）,低体重现象持续至3周龄。3周龄时,限食孕鼠的子代开始了追赶式生长,并在8周龄时,体重明显高于正常子代小鼠（P<0.05）。（3）重亚硫酸盐处理结合限制性内切酶反应结果显示,孕期限食的子代卵母细胞印记基因H19的甲基化水平与对照组一致,未见异常。结论 孕期限食明显增加早产率,并且造成子代低出生体重。在性成熟后,子代有明显的肥胖趋势,但子代卵母细胞印记基因H19甲基化水平正常。     

人类卵子体外成熟及其胚胎冷冻复苏研究

目的:探讨取卵周期准备、卵泡发育状态、培养液成分对未成熟卵的获取率、体外成熟率、受精率、胚胎质量、胚胎移植后成功率及其胚胎冷冻复苏移植的影响。方法:19例进行卵子体外成熟的不孕不育患者为研究对象。其中1例为自然周期,14例为促性腺激素(Gn)诱导排卵周期,4例常规控制性促排卵(COS)周期;分别以TCM 199或人输卵管液(HTF)为基础培养液,进行卵子体外成熟培养。结果:当取卵时卵泡大小不均一且最大卵泡直径≥12 mm时,获卵率、受精率和胚胎质量下降;TCM 199组优质胚胎的形成率显著高于HTF组(P<0.01)。IVM胚胎经冷冻复苏、胚胎移植能获得与常规IVF周期相似的妊娠成功,出生后代健康、无畸形。结论:在IVM周期取卵时卵泡大小不均一且最大卵泡直径≥12 mm时,将影响胚胎着床率和累积妊娠率。TCM 199优于HTF培养液,能提高未成熟卵体外成熟后受精卵所形成胚胎的发育能力。IVM胚胎经冷冻复苏-胚胎移植能获得与常规IVF周期相似的妊娠成功,出生后代健康、无畸形。     

酮色林对表达在卵母细胞上的Kv1.3通道的抑制作用

目的:研究酮色林(KT)对表达在卵母细胞上的Kv1.3通道的作用,探讨其作为心血管药物的潜在免疫效应。方法:在非洲爪蟾卵母细胞表达Kv1.3cRNA通道基因,使用双电极电压钳技术记录通道电流,并用药物干预。结果:KT对Kv1.3通道产生浓度依赖性和可逆性抑制效应,其抑制钾通道50%时的浓度(IC50)为(14.3±1.4)μmol/L。在10μmol/L浓度下,KT降低Kv1.3电流幅值达(43.1±3.2)%;在20μmol/L时降低达(54.1±3.2)%。KT的主要效应是降低电流幅度,对激活曲线和失活曲线无显著影响。对稳态激活曲线,在对照条件下,50%最大激活时的膜电位(V1/2)和曲线斜率(k)分别是(-23.8±0.4)mV和(7.2±0.3);应用10μmol/LKT后,V1/2和k分别是(-22.6±0.5)mV和(8.0±0.4);应用20μmol/LKT后,V1/2和k分别是(-22.3±0.5)mV和(8.1±0.5)。对失活曲线,在对照条件下,V1/2和k分别是(-46.7±0.7)mV和(9.0±0.6);应用10μmol/LKT后,V1/2和k分别是(-48.4±0.7)mV和(8.9±0.7);应用20μmol/LKT后,V1/2和k分别是(-49.2±0.6)mV和(8.8±0.5)。结论:KT在临床相关浓度内,对表达在卵母细胞上的Kv1.3通道有显著的抑制作用。其可能通过抑制淋巴细胞Kv1.3通道,从而抑制淋巴细胞的激活,而在心血管疾病的治疗中有潜在的免疫调节作用。