用PCR插入突变法扩增和克隆HIV—env282肽基因

本文报道借助于微机分析设计并合成了2个引物,通过聚合酶链反应插入突变法扩增出含有4个功能区(T肽区,与NLK部分同源区,显性中和位点及与CD4结合区)的HIV-env282肽基因,其5′端连有EcoR Ⅰ酶切位点和翻译起始码,3′端与终止码和BamH Ⅰ酶切位点相连。通过基因重组将其插入到大肠杆菌表达载体pBV220内并转化至宿主菌DH5α中,经电泳初筛、酶切分析和PCR鉴定,确定了一株含目的基因的重组菌,称之为pXW1。     

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的基因芯片研究

目的 用4096点基因芯片筛选实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型有表达差异的基因。方法 将4096条基因cDNA产物按微矩阵排列点样在玻片上。以髓鞘蛋白脂质蛋白多肽139-151及福氏佐剂为抗原免疫SJL小鼠，取免疫后3-4周急性发病的小鼠及同代正常小鼠各6只，每一只急性发病的小鼠及其对照为一组，分别取全脑组织，于-80℃冰箱保存。提取小鼠全脑组织总RNA，RT-PCR逆转录成cDNA。标记cDNA探针，分别用cy3-dUTP、cy5一dUTP标记正常小鼠和实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的cDNA。将基因芯片和杂交探针变性后杂交，洗干。用Scan Array 4000扫描芯片，GenePix Pro3．0软件分析cy3、cy5两种荧光信号的强度和比值。结果1-6组中筛选出差异表达的数据分别为43、30、176、76、294和129项。这些基因在与两种探针杂交时表现出一定的差异。6个组中一致发现表达异常的基因涉及了免疫相关基因、细胞骨架蛋白基因、细胞周期相关基因、能量代谢相关基因、蛋白质合成相关基因、信号转导及离子通道相关基因等广泛的基因变化。结论 除免疫相关基因外，细胞骨架蛋白相关基因、能量代谢相关基因、蛋白质合成相关基因、细胞周期相关基因、离子通道相关基因等可能参与了自身免疫性脑脊髓膜炎的发病。     

利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒

目的：利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒。方法：根据序列Blast比对分析结果，设计逆转录不对称PCR扩增引物和寡核苷酸检测探针。采用Trizol试剂从人静脉血中提取总RNA，经过逆转录和不对称PCR扩增得到的PCR产物与排列有寡核苷酸探针的芯片杂交，杂交后的芯片经激光共聚焦扫描分析。结果：SARS阳性样品与寡核苷酸芯片杂交后出现阳性杂交信号，具有不同二级结构的寡核苷酸探针杂交信号强度不一。结论：寡核苷酸芯片适于快速准确、平行大量地检测SARS病毒。     

应用组织芯片技术研究卵巢癌组织中缺氧诱导因子1α与血管生成的关系

目的　探讨缺氧诱导因子 1α(hypoxiainduciblefactor 1α ,HIF 1α)在卵巢癌组织中的表达及其与血管生成的关系。方法　联合应用组织芯片和原位杂交、免疫组化技术 ,检测 2 95份卵巢上皮性肿瘤 (其中卵巢癌 2 38份、交界性卵巢肿瘤 19份、良性卵巢肿瘤 38份 )及 13份正常卵巢组织中HIF 1αmRNA和血管内皮生长因子 (VEGF)的表达情况 ,以CD3 4 单克隆抗体标记血管内皮细胞来检测微血管密度 (MVD)。结果　卵巢癌、交界性卵巢肿瘤和良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织中HIF 1αmRNA的阳性表达率分别为 81 9%、4 2 1%、13 2 %和 0。交界性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中HIF 1αmRNA的表达高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤 ,卵巢癌高于交界性肿瘤 ,差异均有统计学意义 (P <0 0 1)。卵巢癌组织中HIF 1αmRNA的表达与手术病理分期和病理类型无关 (P >0 0 5 ) ,而与病理分级呈正相关 (r=0 2 4 6 ,P <0 0 1)。卵巢癌组织中HIF 1αmRNA表达与VEGF表达 (r =0 2 0 6 ,P =0 0 1)和MVD计数 (r =0 4 5 1,P <0 0 1)均呈显著正相关。结论　卵巢癌组织过度表达HIF 1αmRNA ,并通过诱导VEGF促进肿瘤的新生血管形成。     

氪激光诱发大鼠脉络膜新生血管的基因表达谱

目的研究氪激光诱发大鼠脉络膜新生血管的基因表达谱。方法对氪激光诱发BN大鼠脉络膜新生血管的脉络膜组织和正常BN大鼠的脉络膜组织进行总RNA的提取,将纯化后的mRNA进行逆转录制备杂交探针,应用含有5705条Oligo DNA的表达谱芯片对氪激光诱发BN大鼠脉络膜新生血管的脉络膜组织和正常BN大鼠的脉络膜组织进行差异表达谱分析。结果在氪激光诱发BN大鼠脉络膜新生血管的基因表达谱中差异表达基因共有46条,其中上调的基因3条,下调的基因43条。它们分别是物质转运、信号传导、代谢、发育、分化、细胞黏附相关基因。结论氪激光诱发脉络膜新生血管的发生发展涉及多基因改变。（中华眼科杂志,2005,41：317-320）     

结直肠癌相关基因磷脂酶Cε1的筛选及初步验证

目的 筛选新的结直肠癌相关基因并初步验证,探讨结直肠癌的发生、发展机制.方法 在以往研究的基础上,采用基因芯片对既往发现的杂合缺失区域( 10q23.31-24.33)进行扫描,筛选结直肠癌相关候选基因,用real-time PCR初步分析候选基因的表达情况.扩大样本量,通过RT-PCR、免疫组化和Western blot的方法对筛选结果进行初步验证,并结合临床资料分析所筛选基因与结直肠癌发生的关系.结果 基因芯片显示10q23.31-24.33区域磷脂酶Cε1(phospholipase C,epsilon-1,PLCE1)、CPEB3、NKX2-3、SEMA4G 4个基因表达下调,real-time PCR与芯片结果基本一致.RT-PCR、免疫组化和Western blot结果显示PLCE1基因在46％结直肠癌组织中表达下调,年龄＜60岁和低分化腺癌与该基因表达下调相关(P＜0.05),其他临床病理因素与该基因表达下调无明显相关性.结论 PLCE1基因表达下调与结直肠癌的发生相关.PLCE1基因可能对结直肠癌的发生起抑制作用.     

全基因组寡核苷酸芯片筛选与胰腺癌相关的基因信号通路

背景：胰腺癌的发病率有所上升,且缺乏诊断标记物和治疗措施。近年研究表明,基因信号通路在胰腺癌发病中起重要作用。目的：探讨与胰腺癌相关的基因信号通路。方法：6例经病理证实的胰腺癌及其癌旁组织纳入研究。抽提总RNA．合成两种组织探针,探针荧光标记和纯化后,与Agilent全基因组寡核苷酸芯片进行杂交,对差异基因进行生物信息学分析,筛选与胰腺癌相关的信号通路。结果：差异基因的KEGG Pathway分析发现肾细胞癌通路分类对胰腺癌最具生物学意义,其中TGFβ3、EPASI、PIK3R3、EGLN1、PGF、ETS1、VEGFB、CREBBP和PIK3R5九个关键基因的表达有显著差异（P〈0．05）。结论：胰腺癌发病与肾细胞癌通路激活密切相关,可能为胰腺癌的研究提供新的思路。     

应用基因芯片诊断宫颈石蜡组织样本中人乳头状瘤病毒感染及其临床意义

目的探讨应用基因芯片检测宫颈石蜡组织标本中人乳头状瘤病毒（HPV）感染的可能性及其临床意义。方法收集解放军总医院诊断为宫颈鳞状上皮病变的石蜡组织标本40例,其中宫颈浸润性鳞癌18例,宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅲ12例,CINⅠ4例,CINⅡ6例。从组织中提取DNA后采用基因芯片检测23种常见HPV基因亚型,即PCR扩增后产物在基因芯片上进行杂交。同时选用10例经基因芯片检测16型和18型基因阳性的宫颈鳞癌的石蜡组织切片做原位杂交。基因芯片检测结果与部分原位杂交结果进行比较并分析。结果基因芯片检测的18例宫颈鳞癌HPV高危亚型均为阳性（100％）,其中1例为混合阳性;12例CINⅢ中11例为高危亚型阳性（91．7％）,1例阴性;6例CINⅡ的宫颈病变中高危型5例阳性,低危型1例阳性;4例CINⅠ中有2例低危型阳性、2例阴性;宫颈鳞癌和CINⅢ组与CINⅠ和Ⅱ组比较,差异有统计学意义（U=80．0,P〈0．01）。10例宫颈鳞癌基因芯片HPV16型和18型阳性组织中,原位杂交同型探针6例检测显示阳性。结论HPV基因芯片技术可用于检测多种亚型,特异性强,敏感性高,对HPV感染亚型的鉴别及宫颈癌的预防和治疗具有重要意义。     

Sequence Specificity of Alternating Hydroyprolyl/phosphono Peptide Nucleic Acids against Zebrafish Embryo mRNAs

Morpholino phosphorodiamidate (MO) DNA mimics display excellent water solubility and hybridization properties toward DNA and RNA, and have been utilized in the model vertebrate zebrafish (Danio rerio) for genome-wide, sequence-based, reverse genetic screens during embryonic development. Peptide nucleic acids (PNAs) exhibit excellent mismatch discrimination, nuclease resistance, and protease resistance, but low solubility. Negatively charged DNA mimics composed of alternating residues of trans-4-hydroxy-L-proline peptide nucleic acid monomers and phosphono peptide nucleic acid monomers (HypNA-pPNA) combine all of the positive features of both MOs and PNAs. Thus, we evaluated PNA oligomers and HypNA-pPNA oligomers as an alternative to MOs for oligonucleotide inhibition of gene expression in zebrafish embryos. We observed that HypNA-pPNA 18-mers displayed comparable potency to MO 25-mers as knockdown agents against chordin, notail and uroD, with greater mismatch stringency. Furthermore, we observed that a specific HypNA-pPNA 18-mer elicited the dharma (bozozok)^-/- phenotype in zebrafish embryos, which MO 25-mers do not. These observations validate HypNA-pPNAs as an alternative to MO oligomers for reverse genetic studies. The stronger hybridization and greater specificity of HypNA-pPNAs enable knockdown of mRNAs unaffected by MO oligomers.     

直肠腺瘤和直肠癌中 microRNA 表达谱差异

目的对直肠癌miRNA表达谱进行初步研究,以期发现在直肠癌发生过程中与直肠腺瘤miRNA的差异表达谱,并预测可能受其调控的靶基因。方法选择2011年1～3月于解放军第306医院肠镜检查的直肠癌及直肠腺瘤进行检测,筛选直肠癌、直肠腺瘤组织差异表达的miRNA,并运用生物信息软件分析其靶基因。结果通过miRNAs芯片检测,发现直肠腺癌与直肠腺瘤相比,上调的miRNA 34种,下调8种。预测ZFHX4可能为miR-375的靶基因,预测SMAD2等可能为miR-18a的靶基因。结论与直肠腺瘤相比,直肠腺癌有其特异的miRNA表达谱,miRNA在直肠癌的发生中可能起到重要作用。