基因芯片筛选抗胸腺细胞血清性肾炎大鼠肾组织基因表达差异的初步研究

目的： 利用基因芯片检查大鼠系膜增生性肾炎，即抗胸腺细胞血清性肾炎(ATSN)模型大鼠发病 40 min 和 5 d 时肾组织相关基因的表达情况，探讨ATSN大鼠不同时相肾组织基因表达的差异并作功能分析。 方法： 用抗胸腺细胞抗血清（ATS）复制大鼠ATSN模型，抽提发病 40 min 和 5 d 时肾组织RNA，分别用逆转录合成荧光分子掺入的cDNA作探针进行基因芯片杂交。用Agilent 扫描仪扫描，Imagene软件读取数据，最后用Genespring进行normalize处理和差异表达基因的筛选。差异基因筛选标准为实验组/对照组比值（ratio）>或=2为上调基因，实验组/对照组ratio<或=0.5为下调基因。然后选取上调和下调基因登录GenBank查找其相关功能。 结果： 在 9 234 个大鼠基因中（去除质控基因），ATSN大鼠 40 min 时肾组织上调基因为341个，其中部分为凋亡相关的调控基因，部分为增生相关基因及一些与信号转导有关的基因；下调基因为392个，其中一些是酶类基因，部分为生长因子和细胞因子受体基因等，其余大多上调和下调基因功能不详。ATSN发病 5 d 时，肾组织上调基因是213个，包括增生相关基因、信号转导相关基因等；下调基因119个，其中部分为酶类和细胞因子相关基因。5 d 时上调和下调基因大多功能不清楚。 结论： 大鼠ATSN发病早期（40 min），致病相关基因已被激活（如凋亡和增生相关基因），其中相关信号转导分子基因也表达上调，而在ATSN大鼠发病 5 d 时，基因表达谱有所改变，其中涉及的基因多为增生相关基因和信号转导相关基因。     

限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒检测及分型中的应用

目的　探讨限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒B1～B6型检测及分型中的应用。方法　利用GCG软件对柯萨奇B1～B6型病毒cDNA全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析。结果　共 114种限制性内切酶在柯萨奇B1～B6型病毒cDNA中分布有不同数量的酶切位点。经过比较和分析 ,得到了它们的一个共同cDNA片段 ,在这个cDNA片段中 ,B1～B6型病毒各自具有特异性的核苷酸序列 (特异的限制性内切酶位点 ) ,对柯萨奇B组病毒 6个已知型别标准毒株进行了成功的分型和检测。结论　本方法有效地解决了在柯萨奇B组病毒检定以往方法中所存在的非特异性问题 ,可以对柯萨奇B组病毒进行准确的检定和型别鉴定。     

基因芯片筛选尿道下裂雌激素敏感基因的研究

目的 寻找与尿道下裂发病密切相关的基因,探讨尿道下裂形成机制.方法 ①实验组为12例尿道下裂患儿,年龄6～12个月,平均8个月.尿道下裂中度5例,重度7例.组织标本取自尿道成形手术时切取的尿道板组织.②对照组为6例年龄匹配的男性患儿,留取包皮环切时的正常表皮组织.用Tri-Reagent分别提取总RNA,与含22 000个人类基因的寡核苷酸基因芯片杂交、洗脱、染色、扫描,基因强度变化行方差分析(ANOVA,P＜0.01)和Tukey分析,基因表达强度变化＞2倍作为有意义的基因,比较尿道下裂和正常组织之间基因表达差异.从上调表达的基因中选择雌激素敏感基因行RT-PCR,标本除上述患儿RNA外,再增加年龄配对的3例中度、1例重度尿道下裂和2例年龄配对的RNA作为对照,即对照、中度和重度尿道下裂患者RNA标本各8例,验证芯片结果.结果 尿道下裂组织与正常组织之间存在明显的基因表达差异,共筛选出表达强度变化＞2倍的基因94个,其中中度尿道下裂与正常比较,47个基因上调表达(P＜0.01);重度尿道下裂与正常比较,68个基因上调表达(P＜0.001);重度与中度比较,17个基因上调表达(P＞0.05).上调表达的基因中发现了4个雌激素敏感基因CYR61、结缔组织生长因子、ATF3和GADD45β,基因芯片和RT-PCR均证实其在尿道下裂组织中的表达明显高于正常对照.结论 异常表达的基因与尿道下裂的发生有关,尿道下裂组织中雌激素敏感基因上调表达参与了尿道下裂的发病机制.     

脂质体Geneshuttle20对STAT6反义核酸转染小鼠脾淋巴细胞影响的研究

目的探讨阳离子脂质体Geneshuttle20对STAT6反义核酸在小鼠脾淋巴细胞摄入、分布的影响作用。方法采用阳离子脂质体介导STAT6反义核酸转染小鼠脾淋巴细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布。结果反义核苷酸与脂质体(W/W)为2∶4时,细胞摄入率可以达到67.7%,较单独加入反义核酸提高转染效率6倍,细胞内平均荧光强度最强,细胞核染色较深。结论Geneshuttle20提高了细胞对反义寡核苷酸的摄取,促使其进入细胞核内发挥作用。     

糖尿病早期大鼠视网膜血管凋亡相关基因的表达

目的使用基因芯片技术分析糖尿病早期大鼠视网膜血管凋亡相关基因表达概况。方法腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型。在血糖升高后的第6周分别处死正常组大鼠和糖尿病组大鼠各10只，提取20只眼的视网膜血管，一步法提取总RNA。使用(α-32P)脱氧腺苷酸(dATP)标记样品制作探针，与含有1176个基因的尼龙膜芯片进行杂交。使用计算机软件对所获结果进行相关分析。选择3个差异表达的基因进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证。结果糖尿病大鼠第6周，136个基因具有差异表达，占检测基因总数的11.5％。其中，表现为上调的基因90个，占7.6％；表现为下调的基因46个，占3.9％。差异表达涉及多种功能的多个基因。与凋亡信号传导通路相关的72个基因中，有15个出现了表达的差异。表达上调的基因包括肿瘤坏死因子（TNF）家族中Fas相关的死亡域（FADD）、TNF受体家族成员12 （TNFRSF12）、TNF受体家族成员9 （TNFRSF9）和TRAIL；Bcl-2家族的bcl-2,bcl-w,bax和 bak1以及Akt等；表达下调的基因有Fas相关因子（FAF1)。结论糖尿病早期大鼠视网膜血管基因表达发生了复杂的变化，特别是多个凋亡相关通路的基因在糖尿病早期就发生改变，而且多数处在通路上游。提示糖尿病视网膜病变的发生涉及多条凋亡信号传导通路，分子生物化学水平上的变化还仅仅局限在凋亡的诱导期。 （中华眼底病杂志，2008，24：244-248）     

运用压电石英晶体生物传感器检测产气荚膜梭菌α毒素的实验研究

目的研究运用压电石英晶体生物传感器对产气荚膜梭菌α毒素（CPα）进行检测的方法和反应条件。方法按照碱基配对的原则,设计特异的产气荚膜梭菌α毒素基因寡核苷酸探针并利用巯基自组装技术固定在石英晶体上,运用压电石英晶体生物传感器的“质量效应”对聚合酶链反应（PCR）扩增得到的产气荚膜梭菌α毒素靶基因进行杂交检测,并探讨不同pH值和不同离子强度的缓冲液对检测的影响。结果压电石英晶体生物传感器成功检测出产气荚膜梭菌α毒素;pH7.6的缓冲液和0.64mol/L的NaCl溶液最适合于检测。结论压电石英晶体生物传感器能够有效地检测产气荚膜梭菌α毒素,有望对临床上开展毒素诊断提供一种新的手段。     

丁酸钠增强U937细胞凋亡敏感性的分子机制研究

目的 探讨丁酸钠（NaBu)对细胞周期检测点效应及对U937细胞凋亡的敏感性。方法 以U937-ASPI3K（ATM阴性）,U937-pZeosv2( )（野生型ATM基因）两种U937的变异细胞系作为细胞模型。用免疫沉淀及激酶活性测定p38MAPK,ERK1的激酶活性。用免疫印迹分析Bad磷酸化灭活。结果 经NaBu预处理的U937-pZeosv2( )细胞经^137Gs照射后。细胞凋亡敏感性呈NaBu剂量依赖性增强,这种增强效应可被p38MAPK阻滞剂OLM阻断,但不能被p34cdc2激酶的特异性抑制剂ALP及CDK2阻滞剂CDK-2-Ⅰ阻断,经NaBu预处理的U937-ASPI3K细胞经^137Cs照射后,细胞凋亡敏感性进一步增强,这种增强效应可被OLM阻断,放射线可显著增强p38MAPK激酶活性,抑制ERK1激酶活性;NaBu预处理与放射线联用后,对p38MAPK激酶活性的增强有极其显著的协同效应,放射线诱导U937-ASPI3K细胞Bad蛋白磷酸化灭活,在NaBu协同作用下,Bad蛋白磷酸化灭活效应进一步增强。结论 NaBu通过p38MAPK激酶活性,增强细胞凋亡敏感性,该效应与ATM基因是否缺失无关,与ATM失活增强的细胞凋亡敏感性各为独立通路。     

基于生物信息学分析方法设计流感病毒A的通用寡核苷酸探针

目的:设计流感病毒A诊断芯片的寡核苷酸(Oligo)探针.方法:利用BLAST软件对流感病毒A的基因序列进行比对,得到有意义的特异序列;用生物学软件Array Designer4.2设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针.结果:获得10条30 mer的Oligo探针.结论:利用BLAST软件和生物学软件Array Designer4.2设计流感病毒A诊断芯片的探针,可为后期打印成基因芯片,用于流感病毒A的检测打下基础.     

抑制消减杂交与基因芯片技术及其联合应用

抑制消减杂交(SSH)与基因芯片技术是筛选差异表达基因的新方法,因其快速、高效等特点而得以广泛应用。SSH或基因芯片技术单独使用存在不同程度的缺陷或不足,但若将两种技术结合,则能充分发挥各自优势,并能最大限度弥补其不足,从而成为较为理想的克隆系统。     

乙型肝炎病毒X蛋白羧基端30个氨基酸缺失突变体转染Huh7细胞的基因表达谱和蛋白质组差异分析

目的:本课题组既往研究显示乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)羧基端30个氨基酸的缺失突变雄(△HBx)具有明显不同于野生型HBx(wtHBx)的细胞生物学效应,因此,本研究进一步探讨△HBx和wtHBx导致Huh7细胞差异生物学效应的分子基础。方法:采用cDNA芯片和双向凝胶电泳方法,从基因和蛋白质组水平,对分别转染了△HBx和wtHBx的Huh7细胞进行检测。结果:cDNA芯片检测结果显示,对比wtHBx组,△HBx组存在193个基因(0．95％)的显著性改变,154和39个基因分别显示表达上调和下调。双向凝胶电泳结果显示,对比wtHBx组,△HBx组存在147个蛋白差异点。基因表达谱和质谱分析结果显示,△HBx组差异表达的基因和蛋白主要涉及宿主细胞的基因转录、细胞连接、信号转导和代谢、免疫应答等过程及癌基因和抑癌基因。结论:HBx缺失突变体对细胞基因和蛋白质的影响是广泛的,涉及肝组织特异性的代谢基因的变化。这些差异表达的基因和蛋白质在HBx突变致癌过程中是否发挥了重要的作用,需要进一步的研究证实。