耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型及耐药谱分析

目的 研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) SCCmec基因分型情况,并对其耐药谱进行分析.方法 收集从临床标本分离出的MRSA 91株,应用多重PCR法对MRSA进行SCCmec基因分型,采用MicroScanWalk-Away-40全自动微生物鉴定药敏分析仪进行细菌的鉴定及药敏试验,部分药敏试验采用K-B法.结果 91株MRSA中SCCmecⅡ型72株,占79.1％,SCCmecⅢ型16株,占17.6％,未分型3株,占3.3％,未见SCCmec Ⅰ型及SCCmecⅣ型;ICU中MRSA所占比例最多,为SCCmecⅡ型51.4％、SCCmecⅢ型37.5％,2种SCCmec基因型的MRSA对万古霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、利奈唑胺、喹奴普汀/达福普汀的耐药率为0,对氯霉素的耐药率分别为11.1％和12.5％,对利福平的耐药率分别为8.3％和37.5％,其余均呈高水平耐药,2种SCCmec基因型的MRSA均表现为多药耐药.结论 临床分离的MRSA以SCCmecⅡ型为主,且对抗菌药物呈多药耐药.     

Multiplex ARMS PCR to Detect 8 Common Mutations of ATP7B Gene in Patients With Wilson Disease

Background

Wilson disease is a rare disorder of copper metabolism due to mutation in ATP7B gene. Proper counseling of patients with Wilson disease, and their families necessitates finding mutation in ATP7B gene. Finding mutations in ATP7B gene with 21 exons, and more than 500 mutations is expensive and time-consuming.

Objectives

The aim of this study was to provide a simple multiplex amplification refractory mutation system PCR (M-ARMS-PCR) for screening eight common mutations in ATP7B gene.

Patients and Methods

Two sets of ARMS mutant and normal specific primer pairs were designed for genotyping of p.R778L, p.R969Q, p.H1069Q, and p.3400delC mutations as Set 1 and p.W779G, c.3061-1G > A, p.I1102T, and p.N1270S mutations as Set 2. The Multiplex ARMS assay was then subsequently tested in 65 patients with Wilson disease with known and unknown ATP7B mutations.

Results

Using these two sets, we identified H1069Q mutation in four patients, c.2335T > G mutation in three, c.3061-1G > A splice site mutation in five, c.3305T > C mutation in one, and c.3809A > G mutation in two patients.

Conclusions

The Multiplex ARMS assay used in this study can be an efficient, reliable, and cost effective method as a primary screen for patients with Wilson disease.     

鼻咽癌组织中P16基因缺失突变的分析

目的探讨p16基因缺失突变在鼻咽癌中的发生情况与临床意义。方法采用多重PCR分析法,对157例鼻咽癌标本及47例治疗后病理阴性组织标本P16基因突变情况进行了检测。结果鼻咽癌组织中P16基因第2外显子的缺失率高于疗后病理阴性组织,统计学上有显著差异性（P〈0.000）,P16基因第2外显子的缺失与鼻咽癌的临床分期、性别、年龄统计学上无显著差异（χ2值分别为1.726、0.582、0.196,P〉0.05）,P16基因第2外显子的缺失率不足3年生存组高于超过3年生存组,统计学上有显著差异性（χ2=14.12,P〈0.000）。结论P16基因第2外显子缺失可能与鼻咽癌的发生发展预后有关,与临床分期、性别、年龄无关,可作为预后评价指标。     

Evaluation of a multiplex PCR kit for detection of 17 respiratory pathogens in hospitalized patients

BackgroundRapid pathogen identification is critical for optimizing diagnosis and treatment of infectious diseases. Multiplex polymerase chain reaction (PCR) is a sensitive, broad-spectrum molecular detection technique that is simple and rapid to perform. It is capable of simultaneously screening for multiple pathogens within a short time range. Here, we designed and evaluated a multiplex PCR kit for the identification of 17 common respiratory pathogens in clinical samples from hospitalized patients.MethodsA total of 452 samples from hospitalized patients, including 242 respiratory and 210 non-respiratory samples, were analyzed for 13 bacteria and 4 fungi by a multiplex fluorescent PCR kit. The diagnostic performance of the kit was assessed by considering routine microbiology as the reference standard.ResultsThe overall positivity rate of the multiplex PCR kit was 86.9%, much higher than that noted on routine microbiology (56.9%). Furthermore, the co-infection detection rate was also significantly higher than that noted on routine microbiology (69.5% vs. 15.0%). Compared with routine microbiology, kit sensitivity was >90% for detection of most target bacteria, with a negative predictive value (NPV) of >99%, especially for detection of Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis and Escherichia coli. The kit was noted to be particularly superior in identifying Stenotrophomonas maltophilia and Streptococcus pneumoniae as compared to routine microbiology. The multiplex PCR kit was noted to be less sensitive (33.3–59.6%) and more specific (93.9–100.0%) for detection of mycobacteria and fungi.ConclusionsOur multiplex PCR kit offers a rapid and sensitive diagnosis of common bacterial pneumonia, although sensitivity for mycobacteria and fungi warrants enhancement. Further optimization includes minimizing false positivity and increasing relevance to clinical application.     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

4例Williams-Beuren综合征家系遗传学诊断与产前诊断

Williams-Beuren综合征是一类常见的染色体微缺失综合征,早期诊断及干预对患儿及其家庭十分重要。本研究应用染色体核型分析技术(G显带),多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)及微阵列比较基因组杂交技术(array-CGH)对4个家系中1例超声异常的胎儿及3例发育异常患儿行染色体核型和基因组DNA分析,为这4个家庭的再生育提供指导,为产前诊断提供依据。研究结果发现1例产前超声异常孕妇羊水及3例发育异常患儿外周血MLPA分析提示染色体7q11.23区域ELN基因探针信号降低,array-CGH检测提示染色体7q11.23区域杂合缺失。4个家系中母亲再次妊娠时取羊水细胞标本行上述检测均未发现异常。研究结果提示MLPA技术及array-CGH技术能够快速、准确地诊断Williams-Beuren综合征,为临床提供更好的遗传咨询服务。     

ELISA法、荧光免疫法及PCR检测婴幼儿腹泻常见病毒

目的 了解不同方法学检测婴幼儿腹泻常见病毒的检测结果差异及一致性情况.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光法(四联法)及聚合酶链式反应(PCR)技术筛查深圳市福田区引起临床婴幼儿急性腹泻的轮状病毒(RV)、肠道腺病毒(EAdV)、诺如病毒(NV)和星状病毒(AstV)的抗原,并将检测结果数据进行对比.结果酶免法与荧光免疫法检测数据对比:对RV,NV,EAdV的抗原阳性检出率差异有统计学意义(P＜0.05),对AstV抗原阳性检出率差异无统计学意义(P＜0.05);两种方法对RV的检测结果具有较好的一致性(Kappa值为0.558),对NV,EAdV和AstV的检测结果一致性较差(Kappa值分别为0.142,-0.025和0.361);ELISA法和PCR检测数据对比:ELISA法除对EAdV阳性检出率低于PCR外,对其他3种病毒的阳性检出率均高于PCR,且经x2检验显示两种方法对4种病毒的阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05).两种方法对RV,NV,AstV的检测结果具有很好的一致性(Kappa值均＞0.75),对EAdV的检测结果一致性较好(Kappa值为0.537);荧光免疫法(四联法)和PCR检测数据对比:除AstV外,两种方法对其他3种病毒的阳性检出率差异均有统计学意义(P＜0.05).对RV的检测结果具有很好的一致性(Kappa值为0.764),对EAdV的检测结果一致性较好(Kappa值为0.452),NV和AstV的检测结果一致性差(Kappa值分别为0.181和-0.017).结论 ELISA法和荧光免疫法(四联法)对腹泻病毒的检测,除轮状病毒外,其它病毒检测结果的一致性较差,只可用于腹泻病原的初步筛查,确认必须进一步做培养或分子诊断;ELISA法、荧光免疫法(四联法)与PCR三者间的阳性检出率差异均有统计学意义,ELISA法与PCR检测结果的一致性明显较好.以PCR检测结果作为评估标准,ELISA法对四种腹泻病毒抗原的检测灵敏度、特异性及准确性均优于荧光免疫法,荧光免疫法检测结果的假阳性率较高.     

多重PCR法检测外周血单个核细胞中的HBVDNA与HBVcccDNA

目的建立多重聚合酶链反应法(Multiplex Polymerase chain reaction，M—PCR)，揭示慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)中HBVDNA的存在状况。方法采用一种把一套扩增乙肝病毒基因组DNA(HBV genome DNA)的引物和一套特异性扩增乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBVcccDNA)的引物掺入到一个体系中的PCR法，检测PBMC中的HBVDNA核酸分子。结果PCR法可使处于同一PBMC中的总HBVDNA和HBVcccDNA同时分别良好的扩增出来；30例慢性乙肝患者的PBMC中，总HBVDNA与HBVcccDNA同耐检出者23例，检出率76．6％；检出HBVcccDNA者占检出总HBVDNA者的82．1％。结论PBMC中的HBVDNA部分参与复制。成功的建立了能同时检测HBV基因组DNA与HBVcccDNA的M—PCR方法。     

用多引物聚合酶链反应检测鼠疫耶尔森菌

目的建立多引物检测鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的PCR（M-PCR）方法.方法合成4对引物,分别来源于质粒和染色体DNA上F1、pla、Hms、Inv基因,对164株鼠疫菌进行扩增.结果在164株鼠疫菌中,有152株菌4种基因扩增均阳性,仅云南省12株Hms基因扩增为阴性.结论采用M-PCR方法检测鼠疫菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,其可作为检测与鉴别鼠疫菌和疫情监测方面快速诊断的方法.     

部队医院多药耐药鲍氏不动杆菌主要流行克隆谱系的分析

目的 了解我国部队医院中多药耐药鲍氏不动杆菌的主要流行克隆谱系,揭示分子流行的趋势.方法 基于鲍氏不动杆菌的靶标基因ompA、csuE和blaOXA-51-like设计2组特异性引物,并建立了基于序列分型的多重PCR方法;进一步选用该方法鉴定多药耐药鲍氏不动杆菌的主要流行克隆谱系.结果 分离自我国6所部队医院的194株多药耐药鲍氏不动杆菌以Group 1序列型为主,所古的比例高达73.7％除了Group 1序列型外,还发现了属于Group4、Group5、Group8、Group9、Group10序列型的菌株.结论 我国部队医院的流行克隆谱系与欧洲克隆谱系Ⅱ具有高度的同源性;该实验研究中未发现属于Group 2和Group3的菌株,说明在我国部队医院中还未发现存在有属于欧洲克隆谱系Ⅰ和Ⅲ的菌株.