Novel multi-probe RNase protection assay set for detection of endotoxin associated receptors gene expression

Objective: To construct the multi-probe ribonuclease protection assay (RPA) template set to be used for detecting expression patterns of MD-2, TLR4, CD14 mRNAs in human peripheral blood mononuclear cells. Methods : The designed cDNA fragments of the three genes were generated by polymerase chain reaction (PCR)using specific primers and directionally cloned into EcoR I and Hind III sites of expression plasmid pSP72 containing the T7/ promoter, the linearized plasmids was used as template to synthesize anti-sense RNA probes. Then we extracted total RNA from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and detected the dynamic expression patterns of the three genes with RPA method. Results: The proper sequence and orientation of the template set were confirmed by sequencing and the template set was successfully used to assay TLR4, MD-2 and CD14 mRNAs in human PBMC. The results showed that the three detected genes decreased transiently 1-3 hours after 100 ng/ml LPS stimulation. Conclusions: These new RPA multi-probe set provided valuable tool for the simultaneous quantitative determination of expression of TLR4, CD14 and MD-2 mRNAs in both constitutive and inducible types.     

骶尾部瘘合并白塞病1例

患者女,14岁。因肛旁流脓水3年就诊,入院诊断为低位单纯性肛瘘。局部检查：距肛门3cm6点位见一破溃口。可触及条索状物通向肛内,肛周及外阴皮肤溃烂严重。入院第2天,在骶管麻醉下行瘘道切除术,术中顺利,无不良反应,术后经抗炎及换药治疗,23d后创口愈合出院。1个月后,原切口处有一破溃口,带有脓性分泌物,用探针检查瘘道通向骶尾部,经X线检查示：骶尾部骨质未见破坏,诊断为骶尾部瘘。在骶管麻醉下行瘘道切除术。术后病理诊断为骶尾部瘘。     

藏毛窦伴肛瘘1例

患者男25岁,长途客车司机,“反复肛周疼痛6个月,加重1周”入院。专科检查：肛门截石位肛缘6点处可见2．0cm×3．0cm红肿包块,波动（＋）。肛门指诊：齿状线截石位6点处可触及内瘘口,骶尾部皮肤未见异常。骶麻下,以美蓝引导,顺利找到齿状线6点处的内瘘口。行脓肿及瘘一期切开。术中见美蓝向6点骶尾方向伸展,用探针引导,发现此窦道长约3．5cm,根部有大小约0．5cm×1．0cm感染性病灶,内有数根卷曲的毛发及坏死物质,并伴发炎性肉芽组织增生。     

光磁双模态探针钆-[4,7-双-羧甲基-10-(2-荧光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-乙酸络合物合成方法的改进

目的:改进光磁双模态分子探针钆-[4,7-双-羧甲基-10-(2-荧光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-乙酸络合物(Gd-DO3A-EA-FITC)的合成及纯化方法。方法:1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTA)经过取代反应、水解反应、偶联反应、与金属络合反应,合成Gd-DO3A-EA-FITC。结果:改进了Gd-DO3A-EA-FITC的合成路线,分别通过取代反应、水解反应、偶联反应、络合反应得到了光磁双模态分子探针,该反应总收率为34.6%,与原路线(18.0%)相比,总收率增加,各化合物通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和质谱分析法鉴定后结果正确。改进后的路线避免了取代反应不易控制的缺点,且在纯化分离方面,将载样量少、成本高的制备型高效液相色谱纯化改进为载样量多、简便易操作的柱色谱。结论:改进后的路线改善了反应条件的可控性,并且使化合物纯化分离过程变得更加简易,同时使总收率明显提升。光磁双模态探针可同时将活体磁共振成像与离体光学成像相结合,实现光磁双重同步检测,使二者的检测结果相互验证。可将光磁双模态分子探针应用于脑结构及其功能相关研究,并且经静脉途径给药后可以对脑肿瘤进行研究,因此在脑肿瘤和脑血管相关疾病的药物治疗中能够发挥重要的作用。     

细胞和组织中两种线粒体标记方法的比较

  目的  比较探针和抗线粒体蛋白抗体标记细胞及组织中线粒体的效果,为相关研究选取适合的标记方法提供参考。  方法  在经体积分数4%多聚甲醛固定的HepG2细胞中,分别使用100 nmol/L MitoTracker Deep Red探针和抗葡萄糖调节蛋白75（Grp75）抗体标记线粒体;在经体积分数4%多聚甲醛固定的HeLa细胞中,分别使用75 nmol/L、100 nmol/L MitoTracker Deep Red探针和抗Grp75抗体标记线粒体;取人肝组织冰冻切片,经4%多聚甲醛固定后,分别使用150 nmol/L MitoTracker Deep Red和抗Grp75抗体标记线粒体。共聚焦显微镜下观察。  结果  MitoTracker Deep Red探针标记细胞线粒体的效果不如抗Grp75抗体标记清晰,且在HeLa细胞中有非特异性染色,抗体标记可更清楚地反映线粒体的点状和管状分布;在组织中MitoTracker Deep Red探针标记的单个细胞更均匀,标记线粒体的特异性更高,效果优于抗体染色。  结论  在细胞中使用抗Grp75抗体标记线粒体效果更好,能直观反映线粒体的分裂融合状态;在组织中使用MitoTracker Deep Red染色效果更佳。     

RNA恒温扩增-金探针层析法在肺炎支原体检测中的应用

目的:比较RNA恒温扩增-金探针层析法和荧光PCR法检测肺炎支原体的结果,探讨前者在肺炎支原体检测中的临床应用价值。方法:采用整体抽样的方法收集344例临床咽拭子标本,分别用RNA恒温扩增-金探针层析法和荧光PCR法进行检测,以荧光PCR法所得结果为参比,对检测结果进行统计分析。结果:RNA恒温扩增-金探针层析法阳性检出率13. 08%,荧光PCR法阳性检出率12. 79%,差异无统计学意义(χ2=0. 012 9,P>0. 05)。RNA恒温扩增-金探针层析法与荧光PCR法相比阳性符合率为97. 73%,阴性符合率为99. 33%,总符合率为99. 13%,一致性系数(Kappa值)为0. 961 3。结论:二者总符合率高,有相同的检出能力。在此基础上,RNA恒温扩增-金探针层析法作为一种创新方法,还具有操作简单、设备要求不高、结果判读明了等优点,因此该方法在肺炎支原体检测中有很强的临床应用价值。     

新世纪分子影像学的发展现状

本文通过对分子影像学的预期目的 、基本原理、相关技术及其发展等四个方面进行了阐述.分子影像学是近几年才发展起来的一门诊断学,它的出现是医学的一大技术革命.为了使这门科学具有较大的应用前景,人们必须通过长期的努力探索,才能推动分子影像学技术在临床上的应用、发展和进步.     

组织原位杂交法检测肺炎支原体方法的建立

本文建立了用原位杂交法检测实验动物肺炎支原体感染的方法。采用地高辛标记的DNA探针,在病理检查确诊为肺炎支原体感染的标本中出现杂交阳性信号。阴性及特异性对照中未出现阳性信号。肺炎支原体原位杂交的最佳变性温度为80℃。合理的清洗对杂交结果很重要。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

逆转录法制备地高辛标记的食管癌cDNA探针

目的：制备食管癌cDNA探针用于Reverse Northern Blot筛选差异基因片段。方法：提取食管癌组织总RNA,通过逆转录反应,用地高辛标记为cDNA探针。结果;所制备的探针灵敏度高达0．01ng/L.结论：用该方法制备cDNA探针快速、经济,所需模板RNA量少,可用于大规模初筛差异基因片段的研究。