人源性中性内肽酶稳定转染细胞株的建立

目的：获得中性内肽酶（NEP）及失活中性内肽酶（inNEP）稳定表达的细胞株。方法：用酶切及基因测序鉴定质粒pcDNA3．1-hNEP及pcDNA3．1-inNEP（E585V）；以脂质体Ljpofectamjne^TM2000介导pcDNA3．1-hNEP及pcDNA3．1-inNEP（E585V）转染神经母细胞瘤细胞SK-N-SH，分别获得两者的稳定表达细胞株；用RT-PCR及Western blot分析NEP的表达。结果：转染4周后，可见G418单克隆抗性细胞株形成，转染pcDNA3．1．hNEP及pcDNA3．1-inNEP（E585V）的细胞NEP表达均增高。结论：获得稳定转染pcDNA3．1-hNEP及ocDNA3．1-inNEP（E585V）的细胞株。     

SiRNA联合asODN靶向逆转白血病细胞多药耐药的研究

目的:探讨靶向多药耐药基因(MDR-1)的siRNA和asODN联合应用逆转人白血病耐药细胞K562/A02的效果。方法:设计并合成针对MDR-1基因同一序列的siRNA和asODN及阴性对照siRNA,采用转染试剂lipofectin2 000分别转染人白血病耐药细胞K562/A02;利用RT-PCR检测MDR-1mRNA和Western Blot检测MDR-1蛋白质的表达;采用罗丹明123外排实验检测P-糖蛋白(P-gp)的转运功能,MTT法检测K562/A02细胞对阿霉素的耐药逆转效果。结果:siRNA、asODNa、sODN和siRNA联合应用均能降低MDR-1mRNA和蛋白质的表达,提高P-gp的转运功能,对阿霉素的敏感性明显恢复,asODN和siRNA联合应用效果明显提高(P<0.05),低浓度的siRNA(200 nmol/L)比高浓度的asODN(5μmol/L)的效果强(P<0.05)。结论:siRNA、asODN能有效地逆转人白血病耐药细胞K562/A02的多药耐药,asODN和siRNA联合应用效果明显加强。     

下肢深静脉血栓形成患者血浆抗凝蛋白水平检测的临床意义

目的：探讨下肢深静脉血栓形成（LDVT）患者的发病机制，研究抗凝血酶（AT）、蛋白S（PS）、蛋白C（PC）、活化蛋白C抵抗性（APCR）在LDVT患者中的变化。方法：用ACL Puturn 型全自动血凝仪检测LDVT患者100例（初发、复发患者各73、27例）和健康者100例的AT、PS、PC活性及APCR。结果：LDVT组与正常对照组相比，LDVT复发组与初发组相比，AT、PS、PC活性明显降低，APCR阳性率明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01～0.001）；100例LDVT患者中，25例有抗凝蛋白缺陷，以PS缺陷的总发生率最高,占13%(13例),其次是PC缺陷,占8%(8例)，AT缺陷占5%(5例)，APCR缺陷的总发生率最小，占4%（4例）。结论：先天性或获得性抗凝蛋白缺陷是LDVT发病和复发的重要机制之一。     

食管鳞癌中pRb2/p130、Cdk4和c-myc的表达及意义

目的:探讨pRb2/p130、Cdk4和c-myc在食管鳞癌中的表达及意义。方法:应用Immuno-Bridge+免疫组化法检测了pRb2/p130、Cdk4和c-myc在60例食管鳞癌中的表达水平,用χ2检验分析它们与临床病理指标及它们三者之间相互关系,用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并进行生存分析,Cox比例风险模型作预后分析。结果:食管鳞癌中pRb2/p130的低表达与癌组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度有关;Cdk4的高表达与癌组织的分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关;c-myc的高表达与淋巴结转移相关;Kaplan-Meier生存分析表明pRb2/p130高表达组(+)的各期的生存率均高于低表达组(-);Cox比例风险模型分析显示pRb2/p130、淋巴结转移、癌组织分化程度是食管鳞癌的独立预后指标。结论:食管鳞癌中存在pRb2/p130的低表达以及Cdk4和c-myc的高表达,促进了细胞的生长和肿瘤的发展,是食管癌发生发展中的重要事件。     

KAI1基因在食管癌组织中的表达及其意义

目的:探讨KA I l基因的表达与食管癌发生及浸润转移的关系。方法:采用RT-PCR及免疫组化方法,检测食管癌组织及其正常粘膜中KA I lmRNA及蛋白的表达。结果:KA I lmRNA的表达在食管癌组织和其正常粘膜中未见显著性差异,且与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移无关;KA I l蛋白在癌组织中的表达明显低于其正常粘膜,在有淋巴结转移病例中的表达明显低于无淋巴结转移病例,但与肿瘤的分化程度、浸润深度无关。结论:食管癌癌变和转移可能与KM I1蛋白的低表达有关,但与KA I lmRNA的表达无关,推测这可能是由于翻译后修饰所致。     

EGFP Kallikrein重组真核表达载体的构建及其在兔内皮祖细胞中的表达

目的：构建携带人组织激肽释放酶（tHK）基因，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入内皮祖细胞(EPCs)中表达，验证tHK基因修饰EPCs用于血管病治疗的可行性。方法：PCR扩增tHK目的基因，将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP N3上，构建重组质粒载体。并利用脂质体转染体外培养的EPCs，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察tHK EGFP融合蛋白在细胞中的表达；用RT PCR 方法验证tHK在mRNA水平的表达；用ELISA方法验证tHK蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP Kallikrein重组质粒构建正确，重组质粒载体在EPCs 中获得了表达,表达的融合蛋白具有tHK 和EGFP 的双重活性。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEGFP Kallikrein重组质粒载体，并且在EPCs 中稳定表达，为进一步研究tHK基因修饰EPCs双重治疗血管病的技术策略奠定了基础。     

PCR-SSCP快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的:了解本地区结核病耐药基因突变情况,探讨PCR-SSCP作为新的分子药敏试验方法在临床的应用价值。方法:通过提取耐INH、RFP、SM的肺结核患者痰中结核分枝杆菌DNA,进行PCR-SSCP分析,检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL基因是否存在突变,并与传统L-J药敏实验对照。结果:30株耐多药株中,耐RPF、INH、SM基因突变阳性率为90%(27/30)、63%(19/30)、53%(16/30)。3个基因联合突变共8株(26.7%),2个基因联合突变共18株(60%),即26株(86.7%)。单基因突变共2株,2株无基因突变。结论:通过PCR-SSCP方法可检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因,rpoB、katG、rpsL基因突变与本地区结核杆菌对RFP、INH、SM耐药性有关。与传统L-J药敏实验对比,PCR-SSCP是一种敏感、快速的指导临床用药的先进检测方法。     

联合转染p53与血管生成抑素基因对人胃癌细胞系SG7901生长的影响

目的探讨联合转染p53和血管生成抑素(AS)基因对人胃癌细胞系SG7901生长的影响。方法用脂质体转染法分别将p53、AS基因、p53和AS基因转染人胃癌细胞系SG7901。以RT-PCR法检测转染后细胞目的基因的表达,通过细胞集落形成实验、MTT生长曲线、细胞周期检测观察其生物学特性变化。结果p53或AS基因均能抑制转染细胞的生长,而联合转染两种基因的细胞生长抑制更明显。结论p53和AS基因具有协同抑制恶性肿瘤细胞生长作用,提示联合多种基因可能有利于恶性肿瘤的基因治疗。     

外用重组人表皮生长因子治疗宫颈炎62例疗效分析

目的:总结外用重组人表皮生长因子(金因肽)治疗宫颈糜烂的疗效。方法:分析该院2005年11月～2006年4月治疗病例62例的临床资料,其中已生育病例42例选用宫颈微波凝固治疗后局部喷洒金因肽,一次上药。对于年轻未生育患者20例我们仅采用宫颈病灶匙刮至出血再喷洒金因肽,连续3天上药,1天1次。结果:术后1个月创面愈合显效85.7%,有效14.3%。术后2个月后复诊肉眼观察创面愈合情况,痊愈92.9%,有效7.1%。均无出现无效病例。术后并发症状轻微。结论:疗效明显优于现有的治疗方法,可弥补物理治疗方法的不足,临床应用安全可靠,操作简单,未见术后阴道多量出血病例痊愈后宫颈表面光滑、无瘢痕及瘢痕过度生长。具有治愈率高,修复期短等优点。     

GSTM1、GSTT1基因缺失与肺癌易感性的关系

目的探讨谷胱苷肽S转移酶M1（GSTM1）、谷胱苷肽S转移酶T1（GSTT1）基因缺失与肺癌发病之间的关系及其与P16表达降低的相关性在肺癌发生中的作用。方法采用PCR技术检测77例肺癌患者和107例健康对照人群中GSTM1、GSTT1基因缺失的频率，以十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白印迹（WeStern—blot）技术测定P16蛋白在正常组织中的表达。结果病例组GSTM1基因缺失频率为58．4％，显著高于对照组缺失频率为42．1％（X^2=4．811，P=0．028），危险度分析OR=1．938，95％CI=1．070～3．509；病例组GSTT1基因缺失频率为57．1％，接近对照组50．5％缺失频率的水平（X^2=0．802，P=0．371）。联合分析表明，2种基因在肺癌发生中具有协同作用。GSTM1空白基因型与GSTM1非空白基因型个体相比、GSTM1／GSTT1联合空白基因型与其他联合多态基因型相比P16表达水平降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GSTM1基因缺失或GSTM1、GSTT1基因联合缺失在肺癌患者中发生频率增高，可增加个体患肺癌的易感性；GSTM1基因缺失及GSTM1／GSTT1联合缺失可能与抑癌基因p16的蛋白表达减低有关。