HBx蛋白抑制DKK4表达的机制及对肝癌细胞系增殖和迁移的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白下调DKK4的机制及对肝癌细胞系增殖和迁移能力的影响。方法 将编码乙型肝炎病毒X蛋白的腺病毒（Ad-HBx）分别感染肝癌细胞系HepG2和SMMC7721细胞,同时设感染GFP腺病毒（Ad-GFP）为对照组,用去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理肝癌细胞系,并用小干扰RNA-组蛋白去乙酰化酶1（si-HDAC1）及过表达DKK4的慢病毒转染肝癌细胞系。Western blot检测DKK4、HDAC1及SIRT1的表达情况。MTT实验、结晶紫实验和Transwell实验分别检测肝癌细胞系的增殖和迁移能力。结果 Ad-HBx感染肝癌细胞系后DKK4蛋白表达水平下降（P<0.05）,TSA处理后DKK4蛋白表达水平回复（P<0.05）。Ad-HBx感染肝癌细胞系后,HDAC1及SIRT1蛋白水平显著升高（P<0.05）。小干扰RNA沉默HDAC1后能够恢复DKK4的表达（P<0.05）,沉默HDAC1和（或）过表达DKK均能抑制肝癌细胞系的增殖和迁移能力（P<0.05）。结论 乙型肝炎病毒X蛋白通过上调HDAC1、SIRT1来抑制DKK4的表达,沉默HDAC1及过表达DKK4蛋白表达能够抑制感染Ad-HBx肝癌细胞系的增殖和迁移能力。     

MicroRNA-27a通过靶向HBx mRNA抑制HBV复制

目的　探究微小RNA-27a（microRNA-27a, miR-27a）在HBV感染中的作用及分子机制。方法　实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）方法检测miR-27a对HBV DNA和HBV RNA的影响。ELISA法检测miR-27a对HBeAg和HBsAg的影响。生物信息学预测miR-27a的靶基因,然后用双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR和western blot检测miR-27a是否能够直接靶向靶基因以及对靶基因mRNA和蛋白表达的影响。最后用qRT-PCR检测HBV蛋白表达对miR-27a的影响。结果　MiR-27a能抑制HBV DNA、HBV RNA、HBeAg和HBsAg等HBV复制和表达的指标。生物信息学预测和双荧光素酶报告基因检测表明miR-27a能够直接靶向HBx,抑制HBx mRNA和蛋白表达。反之,HBx蛋白表达能抑制细胞内miR-27a的表达。结论　MiR-27a通过直接靶向HBx进而抑制HBV的复制和表达,可以作为一种新的治疗HBV感染的潜在靶点。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

MicroRNA-27a通过靶向HBx mRNA抑制HBV复制

目的 探究微小RNA-27a(microRNA-27a,miR-27a)在HBV感染中的作用及分子机制.方法 实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测miR-27a对HBV DNA和HBV RNA的影响.ELISA法检测miR-27a对HBeAg和HBsAg的影响....     

A comparative study of hepatitis B virus X protein mutants K130M,V131I and KV130/131MI to investigate their roles in fibrosis,cirrhosis and hepatocellular carcinoma

Hepatitis B virus (HBV) genomic mutations A1762T, G1764A and AG1762/1764TA cause production of HBV X protein (HBx) mutants, namely K130M, V131I and KV130/131MI. These mutations are important biomarkers for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC) in chronic HBV patients. This study comparatively analyses the impact of intracellular expression of HBx mutants on HCC cell line Huh7. It was found that expression of KV130/131MI induced: cell proliferation, altered expression of cell cycle regulatory genes in favour of cell proliferation, intracellular reactive oxygen species (ROS) production and mitochondrial depolarization. KV130/131MI may be directly involved in host cell proliferation and hepatocarcinogenesis via altering expression of cell cycle regulatory genes. KV130/131MI may also play pivotal roles in fibrosis and cirrhosis via inducing ROS production and mitochondrial depolarization. Furthermore, these might be the possible reasons for higher occurrence of AG1762/1764TA as compared to A1762T and G1764A in cirrhosis and HCC patients.     

乙型肝炎病毒X蛋白在体外和体内对SMMC-7721细胞生长与分化的影响

近年来,HBV对肝癌细胞生物学行为的影响受到越来越多的关注.我们前期研究结果表明乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)可以诱导肝癌细胞株SMMC-7721发生上皮-间质样表型转化(EMT),并显著增强肝癌细胞侵袭转移潜能[1].     

稳定表达乙肝病毒X蛋白肝癌细胞系的建立及其侵袭性研究

目的构建稳定表达乙肝病毒X蛋白的CCL13细胞系，为研究HBx在诱导肝细胞癌侵袭和转移等生物学行为的作用提供基础。方法将已构建的含HBx基因的真核表达载体pcDNA3．1-HBx质粒，采用脂质体介导法转染到人肝CCL13细胞系并检测HBx的稳定表达。通过体内、体外实验，研究目的细胞的侵袭能力。结果应用PCR技术从已转染的CCL13细胞中克隆出HBx基因，检测有无稳定表达HBx基因的两组CCL13细胞生长曲线、集落形成率、划痕愈合和细胞侵袭力，发现转染细胞的生物学行为有很明显的恶性肿瘤细胞表型。结论成功构建了稳定表达X蛋白且具有高侵袭性的CCL13细胞系，发现该细胞系侵袭能力的条件性。