肝癌组织中HBx蛋白与上皮-间叶样表型转化的关系

目的 探讨肝癌组织中是否存在上皮-间叶样表型转化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)及其与HBx蛋白表达的关系.方法 采用免疫组织化学方法对76例肝癌患者的癌组织标本进行检测.结果 上皮细胞标志物上皮钙黏素、β-连环素表达缺失率分别为34%(26/76)、20%(15/76),HBx和问叶细胞标志物神经钙黏素、纤维连接蛋白表达阳性率分别为68%(52/76)、55%(42/76)、46%(35/76);上皮钙黏素表达缺失与神经钙黏素和HBx蛋白阳性表达有关(P＜0.01),神经钙黏素和纤维连接蛋白阳性表达与β-连环素表达缺失和HBx蛋白阳性表达均有关(P＜0.05).结论 肝癌组织中存在EMT,其发生可能与HBx蛋白表达有关.     

乙型肝炎病毒X基因在体内外对肝癌细胞增殖活性的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒x(HBx)基因对肝癌细胞增殖活性的影响。方法将携带HBx基因的表达质粒pHA-HBx转染HepG2肝癌细胞,G418筛选阳性细胞克隆,RT-PCR鉴定HBx基因的整合及表达;通过细胞计数,观察HBx基因对肝癌细胞生长曲线和倍增时间的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;^3H-TdR掺入法检测细胞增殖活性;裸鼠接种观察HBx基因在体内对肝癌细胞增殖的影响。结果HBx基因在体内外对HepG2细胞的增殖活性均有明显影响,细胞生长曲线左移,倍增时间缩短;G0／G1。期细胞减少,S期和G2／M期细胞增多;转染后的细胞^3H-TdR掺入率较对照组增高;转HBx基因的裸鼠移植瘤的生长速度较对照组细胞明显加快。结论HBx基因在体内外均可提高肝癌细胞的增殖活性,增加肝癌细胞的恶性表型,加速肿瘤生长。     

乙型肝炎病毒X基因在大肠杆菌中亚克隆与鉴定

用ＨｐａⅠ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切３２ｋｂＨＢＶＤＮＡ，得到近１１ｋｂ大小的完整ＨＢｘ基因，利用绿豆芽核酸酶将ＨＢｘ基因、载体ｐＢＲ３２２的ＢａｍＨⅠ酶切粘性末端切成平末端，在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下进行体外重组后转化到大肠杆菌中，获得亚克隆Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９ｐＢＲ３２２ＨＢｘ，并经药物平板筛选、电泳分析和ＤＩＧ标记的探针做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交实验证实。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９ｐＢＲ３２２ＨＢｘ亚克隆的建立对进一步研究ＨＢｘ基因的功能、肝癌发生的机理以及乙型肝炎病毒感染的诊断等均有重要意义     

Calcium ions affect the hepatitis B virus core assembly

Previous report showed that cytosolic Ca2+ induced by hepatitis B virus X protein (HBx) promotes HBV replication. In this study, in vitro experiments showed that (i) HBV core assembly in vitro was promoted by Ca2+ through the sucrose density gradient and the analytical ultracentrifuge analysis. Also, (ii) transmission electron microscope analysis demonstrated these assembled HBV core particles were the capsids. Ex vivo experiments showed that the treatment of BAPTA-AM and cyclosporine A (CsA) reduced HBV capsids in the transfected HepG2 cells. In addition to that, the treatment of Thapsigargin (TG) increased HBV capsids in the transfected HepG2 cells. Furthermore, we investigated the increased HBV core assembly by HBx. The results show that the increased cytosolic calcium ions by HBx promote the HBV core assembly.     

乙型肝炎病毒X基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的] 构建和表达乙型肝炎病毒x基因原核表达载体，获得重组HBx蛋白。[方法] 用PCR方法扩增含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列，分别以pMD18-T载体和pET32a（＋）载体构建pMD18-T-HBX克隆载体和pET32a-HBX原核表达载体，随后把pET32a-HBX转化大肠杆菌BL-2l进行诱导表达和纯化，Western blot检测原核表达的HBx蛋白的免疫活性。[结果] 经IFFG诱导后可见分子量约38KD的融合蛋白表达；表达的蛋白主要以包涵体形式存在；Western blot结果表明HBx融合蛋白具有较好的免疫活性。[结论] HBVX基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化。为研究HCC患者血清中HBx蛋白和抗-HBx抗体滴度水平奠定了坚实的基础。     

稳定表达HBx基因的HepG2细胞对顺铂敏感性的变化及其机制研究

目的 探讨乙肝病毒x基因(HBx)对肝癌细胞株HepG2化疗敏感性的影响及其机制。方法 1.构建HBx的真核表达载体;2.脂质体法转染HepG2,G418筛选得到稳定表达HBx-ORF的阳性细胞克隆;3.Western blot法检测转染前后磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)的表达变化;4.MTT法检测转染前后HepG2对顺铂的反应,以及用PD98059特异性阻断ERK1/2激活通路后HBx+HepG2对顺铂敏感性的变化。结果 1.稳定表达HBx-ORF的HepG2中p-ERK1/2的表达明显强于阴性细胞;2.稳定表达HBx-ORF的HepG2在2μg/ml顺铂作用24小时后,顺铂对其抑制率为19.45％±2.50,明显低于阴性组的33.15％±2.85和转染空质粒组的30.79％±2.66(P<0.05);用PD98059阻断阳性细胞中ERK1/2的激活之后,相同剂量,时间作用下,对HBx+HepG2的抑制率上升至32.28％±4.22,明显高于阻断前(P<0.05)。结论 HBx通过ERK通路介导肝癌细胞的抗化疗反应,ERK通路有可能成为乙肝后肝癌辅助治疗的靶点。