高分压氧处理对体外培养大鼠脾淋巴细胞增殖及杀伤能力的影响

目的观察大鼠体外脾淋巴细胞经不同压力—时程的高分压氧处理后淋巴细胞增殖及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤能力的变化。方法分离成年大鼠脾淋巴细胞,置于高压细胞培养舱内,以不同压力—时程的高分压氧(含CO25 kPa)处理,W ST-8比色法测定经刀豆球蛋白(ConA)刺激后淋巴细胞的增殖率和对肿瘤细胞株P815的杀伤能力。以常压空气(含5%CO2)处理作为对照组。结果一定压力—时程的高分压氧处理对体外培养的大鼠脾淋巴细胞增殖及杀伤能力具有促进作用,但随暴露剂量的增加则逐渐表现为抑制效应。结论高分压氧对离体大鼠脾淋巴细胞增殖及杀伤能力存在一个从适度暴露促进功能发挥至过量暴露抑制功能发挥的过程。     

DC联合小剂量IL-2大量扩增白血病特异性CTL的实验研究

目的： 建立和优化体外大量扩增白血病特异性CTL的方法。 方法： 用1×107FBL3细胞冻融产物（FBL3LY）冲击的DC每10天1次对C57BL/6小鼠反复接种，在第3次接种5 d后处死小鼠制备脾T细胞，每周用FBL3LY冲击的DC刺激，体外培养10 d后加入小剂量的IL2。 结果： 共培养至21 d， T细胞可扩增100倍以上，其中CD8+细胞比率明显增高。乳酸脱氢酶释放试验证实扩增所得CTL对FBL3细胞具有高效的杀伤作用（81.84±8.68%），而对K562细胞无特异性杀伤作用。 结论： FBL3LY冲击的DC联合小剂量IL2可大量扩增FBL3白血病特异性CTL，该方法的建立对提高白血病特异性CTL免疫治疗的临床疗效具有重要意义。     

CVB3心肌炎CTL亚类TCR Vβ基因取用格局分析

目的探讨柯萨奇病毒（CVB3）心肌炎细胞毒T细胞（CTL）亚类（ACTL、VCTL、MCTL）TCR CDR3 Vβ基因取用格局。方法无菌摘取72h内新生Balb／c鼠心脏,培养单层心肌细胞并将其分为三组,分别用CVB3、放线菌素D处理和不经过任何处理;实验组制备CVB3心肌炎鼠模型,处死后将其肠系膜淋巴结制成单细胞悬液,分别加入上述三组单层心肌细胞,采用免疫吸附法获取ACTL、VCTL、MCTL,对照组鼠为正常小鼠处死后取肠系膜淋巴结制成单细胞悬液;采用MTT法对实验组ACTL、VCTL、MCTL和对照组T细胞进行细胞毒鉴定;常规进行RT-PCR,判断实验组细胞及对照组细胞的TCR Vβ基因取用格局。结果对照组T细胞表达Vβ基因全部20个家族,而实验组三类CTL的Vβ基因取用格局呈现明显的限制性,ACTL优势表达Vβ36、Vβ8．1、Vβ8．2、Vβ8．3,MCTL优势表达Vβ5．1、Vβ8．1、Vβ8．2、Vβ8．3,而VCTL优势表达Vβ7、Vβ8．1、Vβ8．2、Vβ8．3。结论CVB3心肌炎中导致心肌细胞损伤的CTL受到特异性抗原刺激后其TCR Vβ基因取用格局呈现明显的限制性。     

黄热病毒特异性抗原片段的筛选与鉴定

目的通过系统的生物信息学分析和实验验证,筛选黄热病毒的特异抗原片段,为免疫诊断试剂的研制奠定基础。方法分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对黄热病毒蛋白进行分析,参考亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性及二级结构信息,对黄热病毒可能的共有及特异性抗原表位进行系统的预测分析,分析其在不同毒株中的保守性,并对预测得分值较高的抗原区域进行RT-PCR扩增,利用pMal-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应原性,检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,进一步验证其免疫学反应特异性及检测敏感性。结果其中27段抗原片段获高效表达,经Western blot筛选及ELISA进一步验证,原核表达抗原片段YFV22表现良好特异抗,可检测低至1∶12 800倍稀释的黄热病毒多克隆抗体,与所试其他参考病毒多克隆抗体无交叉反应。结论经系统筛选、验证,获黄热病毒特异性抗原片段1段,为其免疫学诊断试剂的研制奠定了基础。     

Antigenicity Alternations of Variant PEDV S Protein Disclosed by Linear B Cell Epitope Mapping

The spike protein (S) plays a crucial role in porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection and induces neutralizing antibodies. Mutations of the S protein are supposed to provide the main antigenic shift leading to the antigenic escape of PEDVs. It is therefore a significant question how much accumulation of antigenic shift could lead to the antigenic escape of the variant PEDV. To provide an answer in the study, B cell epitopes (BCEs) on the S protein of the PEDV vaccine strain CV777 (S^CV777) and variant strain SD2014 (S^SD2014) were mapped using biosynthetic peptides and rabbit anti-PEDV S serum. Seventy-nine and 68 linear BCEs were identified from S^CV777 and S^SD2014, respectively. While 66.2% of the BCEs of S^SD2014 could be recognized by anti-S^CV777 serum and 67.1% of S^CV777 BCEs could be recognized by anti-S^SD2014 serum, more than 40% of the BCEs identified using anti-S^CV777 serum on S^CV777 could not be recognized by anti-S^SD2014 serum and vice versa. The completely shared BCEs took low percentages of 29.4% and 25.3% for S^SD2014 and S^CV777, respectively. These results indicate a low conservation of antigenicity of the S protein compared to a relatively high amino acid sequence similarity of 92.2% between the two strains. The study provided a BCE shift reference of PEDV antigenic escape and surveillance control.     

丙型肝炎病毒HLA-A＊1101和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位的研究

目的：鉴定出丙型肝炎病毒（HCV）特异性HLA-A＊1101限制性和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.方法：采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8＋T细胞表位,合成HLA-A＊1101限制性、A＊2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A＊1101阳性、A＊2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A＊1101或A＊2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A＊1101阳性或A＊2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞（PBMCs）后,采用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素（IFN-γ）的细胞的水平和（肝） 异性IFN-γ＋CD8＋T细胞的水平.结果：5条HLA-A＊1101限制性候选表位中,NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（VVFSDMETK）与HLA-A＊1101分子具有高结合力.3条HLA-A＊2402限制性候选表位中,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）与HLA-A＊2402具有高结合力;在HLA-A＊1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3 609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞,而在HLA-A＊2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b 382特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞.结论：本研究证实NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（WFSDMETK）为全新的HCV特异性HLA-A＊1101限制性CD8＋T细胞表位,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）为全新的HCV特异性HLA-A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.     

汉滩病毒S基因5''端311bp编码蛋白的原核表达、纯化及其抗原性分析

目的进一步了解汉滩病毒核蛋白氨基端的抗原特性. 方法构建汉滩病毒S基因5端311 bp片段的原核表达载体,并诱导表达和纯化了Mr 3.6×104的融合蛋白(汉滩病毒核蛋白氨基端Mr 1.0×104与Mr 2.6×104 GST融合);用mAb,以Western-blot和ELISA方法对该蛋白的抗原位点进行了鉴定. 结果与完整核蛋白反应的mAb中仅有部分与Mr 3.6×104融合蛋白反应,而与核蛋白氨基端Mr 2.6×104片段反应的5株mAb(1A8,A35,8E8,3A9,3G11)都能与Mr 3.6×104融合蛋白反应. 结论汉滩病毒核蛋白氨基端Mr 1.0×104以内存在一个或几个线性表位,而羧基端可能主要起着维持完整核蛋白立体构象的作用,并影响识别立体表位的mAb与该蛋白的结合.     

新型冠状病毒疫苗免疫BALB/c小鼠后的T细胞表位鉴定

目的 鉴定携带新型冠状病毒S、N和M基因的疫苗在BALB/c小鼠上的T细胞表位。方法 用携带新型冠状病毒S、N和M基因的DNA疫苗和痘病毒载体疫苗免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,末次免疫1个月内取小鼠脾细胞,用ELISPOT法检测其对新型冠状病毒特异性多肽的T细胞免疫反应,筛选出具有阳性反应的多肽片段,并对其表位进行预测分析。结果 S、N、M基因分别鉴定出12、2、17条阳性多肽。S基因中多肽S49、S50、S100、S101、S102、S103阳性反应率为100%,且免疫刺激指数最高;覆盖M蛋白全长的41条多肽中有7条能刺激50%以上的小鼠产生阳性反应。预测分析结果显示,S、N、M基因分别有10、1、16个MHC-1 H-2限制性表位,主要位于S基因的RBD区、N基因RBD区以及M基因的跨膜区。这些表位在SARS-CoV-2及其变异株、SARS-CoV中高度保守。结论 新型冠状病毒DNA疫苗和痘病毒载体疫苗诱导了针对多个基因、多个表位的特异性T细胞应答,未来通用型疫苗设计应包含能诱导细胞免疫的多个抗原,特别是包含保守表位的结构抗原。     

小鼠MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ类分子限制性表位MAGE-3多肽疫苗的设计及其免疫效应

[目的]设计小鼠MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ类分子限制性表位黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)多肽疫苗即包含CD4~+一CD8~+T细胞表位的MAGE-3多肽抗原,并探讨其免疫效应.[方法]采用计算机模拟设计的方法,结合文献资料选择MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ类分子限制性表位的MAGE-3多肽.采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)、细胞毒性实验评价多肽诱导T淋巴细胞的增殖能力及刺激的T淋巴细胞释放细胞因子的能力.[结果]获得的联合表位多肽序列为FITC-YEEYYPLIFLDNDQETMETSEEEEYEEYYPLIF,高效液相色谱法分析多肽纯度≥90%.MAGE-3表位多肽抗原能够诱导T淋巴细胞增殖,并诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ,高于对照组(49%vs spots/10~6,P≤0.05).MAGE-3表位多肽可诱导细胞毒T淋巴细胞使42%的MFC细胞溶解破裂,高于对照组(P≤0.05).[结论]包含CD~+-CD8~+T细胞表位的MAGE-3多肽抗原在体外实验中显示有一定的免疫效应,此抗原肽可作为多肽疫苗用于对表达MAGE-3抗原的H-2K<'K>型小鼠胃癌进行免疫治疗.     

Clinical significance of variations in levels of Epstein-Barr Virus (EBV) antigen and adaptive immune response during chronic active EBV infection in children

Abstract

Pediatric patients were recruited to analyze differences in Epstein-Barr virus (EBV) copy numbers and adaptive immune reactions in children with chronic active vs acute EBV infection (CAEBVI vs AEBVI), as well as to examine the relationship between these parameters and the pathogenesis of CAEBVI. Fluorescent qPCR was used to assess EBV-DNA levels, while ELISA, antibody affinity, flow cytometry, and heterophil agglutination (HA) assays were used to evaluate patient EBV-adaptive humoral and cellular immunity. Lastly, ELISPOT was employed to assess interferon (IFN)-γ secretory functions of EBV-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL) as a marker of subject EBV-specific adaptive cellular immunity. The results indicated that, compared with AEBVI patients or normal children, there was a dramatic elevation in viral copy levels, viral capsid antigen (VCA)-IgA, early antigen (EA)-IgA, and EA-IgG, but a lack of EBV nuclear antigen (EBNA)-IgG and a negative HA in CAEBVI patients (p?<?0.01). These subjects also had decreased CD4⁺, CD8⁺ (naïve), CD8⁺CD38⁺, and effective memory T-lymphocyte levels compared with AEBVI patients (p?<?0.01), and decreased EBV-specific CTL function compared with normal children (p?<?0.01). These results suggest that there is a disturbance in EBV antigen availability and in both the adaptive humoral and cellular immune responses in patients with CAEBVI, and that these outcomes may be associated with the chronic active re-infection process itself associated with CAEBVI.