人可溶性TRAIL蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 初步观察并探讨人重组可溶性TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用，并通过实验初步探讨TRAIL对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。方法 MTT法测定TRAIL对MG-63细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞的抑制率；电镜观察与FACS分析TRAIL蛋白诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的作用；用RT-PCR检测TRAIL受体在MG-63骨肉瘤细胞、MRC-5人肺二倍体细胞及L-02人肝细胞上的表达，并初步分析TRAIL诱导MG-63骨肉瘤细胞凋亡的机制。结果 MTT还原试验表明：作用24h后500ng/ml TRAIL的抑制率为10.1％，1μg/ml TRAIL的抑制率为24.3％，2μg/ml TRAIL的抑制率为50.6％，5μg／ml TRAIL的抑制率为95％以上，其半数抑制浓度为2μg/ml。而TRAIL对MRC-5人肺二倍体细胞株及L-02人肝细胞株无明显作用。细胞形态学观察显示：MG-63骨肉瘤细胞经TRAIL作用3～8h后即有部分细胞开始变小、变圆，24h后大量细胞变圆、脱落，漂浮于培养液中。透射电镜可观察到核固缩，染色质浓聚于核膜形成新月状小体。流式细胞仪检测显示2μg／ml的TRAIL处理MG-63骨肉瘤细胞6h，即可在二倍体峰前出现较明显的凋亡峰。结论 人可溶性TRAIL蛋白可以迅速地选择性杀伤MG-63骨肉瘤细胞，具有潜在的临床应用价值。     

血管内皮生长因子和Fas配体共表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)和Fas配体(FasL)共表达质粒，并鉴定其在细胞中的表达情况。方法 根据入VEGFl65和FasL的cDNA序列分别设计、合成引物，经扩增、连接、酶切、插入等得到重组表达质粒pCI-VEGFl65和pCI-FasL。再以此为基础构建得到编码FasL和VEGFl65的共表达质粒pCI-FasL-IRES-VEGFl65(简称pCI-FIV)。用脂质体将各表达质粒(2μg)转染NIH3T3细胞，用流式细胞术、ELISA和Western-blot检测其FasL和VEGFl65表达情况。结果 细胞裂解液的Western-blot检测表明，重组质粒pCI-VEGFl65和pCI-FIV能表达VEGFl65。分子量与预期kD一致。细胞培养上清的ELISA检测表明，pCl-VEGFl65和pCI-FIV均能分泌性表达vEGFl65。流式细胞仪检测表明，质粒pCI-FasL、pCI-FIV稳定转染的NIH3T3细胞表面的绿色荧光阳性率分别为98．0％和96．5％，而空载体转染细胞的阳性率为3．2％。ELISA检测结果显示，pCI-FasL、pCI-FIV转染NIH3T3细胞培养上清中均存在可溶性FasL。结论 成功构建的FasL和VEGFl65共表达质粒可成功转染细胞并能分泌性表达VEGFl65，同时可表达膜结合形式的FasL和可溶性FasL，为将来血管内膜增生的基因治疗奠定了基础。     

胎儿和少儿皮肤内碱性成纤维细胞生长因子及其受体的基因表达

目的　探讨不同胎龄的胎儿和少儿皮肤中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)及其两种受体 (bek和flg)基因表达的变化。 方法　提取 18例不同胎龄 ( 13～ 3 2周 )的胎儿皮肤和 6例少儿皮肤的总RNA后 ,分离mRNA ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测这 3种基因在不同组织中的表达。结果　在早期妊娠胎儿的皮肤中 ,bFGF ,flg和bek基因表达较强 ,随着胎儿的生长和发育 ,皮肤组织内这 3种基因表达逐渐降低 ,在少儿皮肤中 3种基因的表达量分别为晚期妊娠胎儿皮肤的 62 .5 % ,5 9.5 %和 5 2 .9% ,基因表达显著降低 ( P <0 .0 5 )。结论　bFGF及其受体基因可能在皮肤的发生、结构功能的维持以及伤后修复中起重要作用。这 3种基因在胎儿皮肤中表达水平较高可能与胎儿皮肤细胞增殖较快 ,皮肤创面愈合迅速有关。     

同种异体心脏移植中供体特异输注对肿瘤坏死因子-α的影响

目的　通过术前 2 4h特异输注与环孢酶素A(CsA)联合应用研究其对肿瘤坏死因子 α(TNF α)的影响。方法　将小鼠随机分组为CsA/红细胞 ,CsA/全血 ,以及红细胞 ,周围淋巴细胞 ,全血 ,低剂量CsA ,空白对照磷酸盐缓冲液 (PBS)组。术前给予相应的供体特输注 (DST) ,空白对照组注射PBS液。心脏移植方法采用耳后方法 ,实验终止后用放射免疫方法测定受体血清中的TNF α。结果　单独DST组 ,低剂量CsA组和空白对照液组之间的TNF α含量差异无显著性(P >0 .0 5 )。CsA/DST组的含量明显低于低剂量CsA组 ,空白对照PBS组和DST组 (P <0 .0 1) ,其中CsA/周围淋巴细胞组中TNF α含量为最低 2 .3 9± 0 .49(P <0 .0 1)。结论　术前 2 4h单独输注DST并不能降低受体血清中TNF α的含量 ,然而DST和CsA联合应用可以降低受体血清中的TNF α含量 ,其中以周围淋巴细胞和CsA联合应用效果最佳。     

黄芪当归合剂及依那普利对结缔组织生长因子在肾间质纤维化中表达的比较研究

目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)在肾间质纤维化中的表达及其在依那普利、黄芪当归合剂的肾脏保护作用中的意义。方法 采用单侧输尿管结扎致肾间质纤维化大鼠模型。将大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、黄芪当归组、依那普利组。术后第9天处死各组大鼠,经免疫组织化学(组化)、Western蛋白印迹分析方法观察各组CTGF的表达部位及蛋白表达水平。用免疫组化半定量检测各组肾间质的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。用天狼星红染色半定量检测以Ⅰ型胶原为主的肾间质胶原成份。Masson染色评定各组肾小管间质损害程度。结果 模型组CTGF、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达及肾小管间质损伤指数明显高于假手术组(P<0.01),而黄芪当归组及依那普利组明显低于模型组(P<0.01)。两治疗组间比较,除结缔组织生长因子外(P<0.01),其余指标无显著性差异(P>0.05)。各项指标作相关分析,CTGF与肾小管间质损伤指数(r=0.788,P<0.01)、α-SMA(r=0.940,P<0.01)、Ⅰ型胶原(r=0.820,P<0.01)为正相关关系。结论 黄氏当归合剂及依那普利可能通过下调CTGF而减轻肾间质纤维化。     

血管内皮生长因子及其受体mRNA在乳腺癌组织中的表达

目的　研究血管内皮生长因子及其受体FLT 1、FLK 1mRNA在乳腺癌组织中的表达及与临床病理因素的相关性。　方法　采用逆转录聚合酶链反应技术对手术的 47例乳腺癌标本 ,11例乳腺良性病变标本中血管内皮生长因子 (VEGF)及其受体FLT 1、FLK 1mRNA的表达进行检测。结果　在良、恶性乳腺组织中均检测到VEGF12 1、165mRNA的表达 ,在乳腺癌组织中表达水平分别为0 42 0± 0 13 3、0 2 91± 0 0 94高于良性乳腺组织 0 196± 0 0 67(P =0 0 0 0 )、0 2 0 6± 0 0 5 8(P =0 0 0 1) ;在乳腺癌组织中 ,VEGF12 1mRNA表达高于VEGF165mRNA(P =0 0 0 0 ) ,而在良性乳腺组织中两者表达水平差异无显著性意义 (P =0 666)。FLT 1、FLK 1mRNA在部分乳腺癌组织中表达 ,分别为 3 8 3 %(18/4 7)和 2 5 5 % (12 /4 7) ,而在良性乳腺组织中未见表达。乳腺癌组织中VEGF12 1、VEGF165、FLT 1、FLK 1mRNA表达与患者年龄、肿块大小、淋巴结转移状况、肿瘤分期及雌、孕激素受体状况之间无明显相关性。　结论　乳腺癌组织中VEGF12 1、165及其受体FLT 1、FLK 1mRNA表达水平上调 ,提示其在乳腺癌的血管生成中起着重要作用。     

重组逆转录病毒pLNCX2-GDNF转染许旺细胞及其表达

目的 利用基因转染技术将胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因转入许旺细胞(SC)以提高其分泌该因子的水平。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)方法合成GDNFcD—NA片段，以逆转录病毒pLNCX2为载体导入许旺细胞内，并运用RT—PCR、免疫细胞化学染色、ELISA及运动神经元联合培养法检测外源性基因在mRNA和蛋白水平的表达及其产物的活性。结果 RT—PCR检测结果示GDNF—SCs表达GDNFmRNA的水平明显优于SCs；免疫细胞化学检测发现GDNF—SCs抗GDNF蛋白染色呈强阳性，正常SCs呈弱阳性；ELISA法检测结果示转染后4周GDNF—SCs分泌GD—NF蛋白的水平升至正常SCs的5．1倍；运动神经元联合培养法结果显示GDNF—SCs分泌的外源性基因产物具有生物学活性。结论 GDNF基因转染SC在mRNA和蛋白水平表达GDNF明显优于正常SCs，外源性基因表达产物具有神经生物学活性。     

胰岛素生长因子1在颅缝闭合中调节作用的实验研究

目的：研究胰岛素生长因子1对大鼠颅缝细胞的骨诱导作用和体外调节小鼠矢状缝闭合的作用。方法：获取新出生的SD大鼠的矢状缝细胞进行培养和出生8d的CD1小鼠矢状缝进行体外无血清器官培养基培养，加入胰岛素生长因子1（insulin lilce growth factor 1 IGF1），浓度分别为10ng/ml和40ng/ml，并设立不加IGF1者为对照组，应用RT－PCR检测颅缝细胞的成骨细胞表型碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白mRNA表达，ELISA法检测培养液I型胶原的分泌，光镜观察小鼠矢状缝闭合的情况。结果：加入IGF1的矢状缝细胞的成骨细胞表型碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白mRNA表达以及培养液I型胶原分泌量较对照组明显增高。有IGF1干预的矢状缝移植体培养8d时，颅缝内侧面骨板开始接近，培养20d时，颅缝小部分闭合，培养30d时颅缝大部分闭合，无IGF1干预的对照组培养30d，颅缝未发生闭合。结论：胰岛素生长因子1通过增强颅缝细胞的骨诱导促进颅缝的闭合。     

NFκB抑制剂对大鼠肝脏移植再灌注损伤的保护作用

目的　探讨大鼠肝脏移植后核因子κB(NFκB)活化对炎性介质表达和中性粒细胞浸润集聚的影响。方法　供受体鼠分别于术前 15min腹腔注射NFκB抑制剂脯氨酸二硫代氨基甲酸酯 (ProDTC 15mg/kg)。 结果　与对照组相比 ,应用ProDTC者移植后NFκBp6 5含量、肿瘤坏死因子 α(TNF α)、巨噬细胞炎性蛋白 2 (MIP 2 )、细胞间粘附分子 1(ICAM 1)mRNA表达和蛋白表达明显下降 ;髓过氧化物酶 (MPO)活性明显减低 (P均 <0 0 1)。ProDTC也显著降低天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶 (ALT)、乳酸脱氢酶 (LDH)水平 (P <0 0 1)。结论　ProDTC抑制移植后NFκB活化从而下调了TNF α、MIP 2、ICAM 1表达从而减轻中性粒细胞浸润及肝脏缺血再灌注损伤。     

肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体-4在人胰腺癌组织中的表达

目的：通过检测肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体-4(TRAIL-R4)在胰腺癌组织中的表达，探讨胰腺癌细胞抵抗细胞凋亡的机理。方法：应用mRNA印迹法(Northern blotting)、蛋白质印迹法(Western blotting)和免疫组织化学技术，定性、定位分析TRAIL-R4在正常胰腺组织和胰腺癌组织中的表达。结果：TRAIL-R4 mRNA和蛋白在正常胰腺组织中呈弱表达或不表达，而在胰腺癌组织中呈高表达；免疫组织化学检测显示，在胰腺癌细胞中TRAIL-R4蛋白呈强染色。结论：TRAIL-R4表达水平在正常胰腺组织与胰腺癌组织中存在显著差异，提示胰腺癌细胞中可能存在对TRAIL介导的细胞凋亡抵抗新机理。