双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌

目的建立改良分子信标双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时PCR反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUPCR反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

水产品中霍乱弧菌的分离鉴定及生物分型报告

目的 了解肇庆市售水产品中霍乱弧菌的污染状况及霍乱弧菌分离株的噬菌体-生物分型情况,研究其分子遗传学特征及流行病学意义.方法 2004年7月,采集肇庆市各水产品交易市场的海、水产品及其养殖水,按国标方法进行霍乱孤菌分离鉴定,采用噬菌体-生物分型区分检出菌是否为流行株.结果 从87份样品中共检出9株霍乱弧菌,检出率为10.35%.其中分离自青蛙5株、牛蛙3株、养殖水1株.分离的菌株均为01群埃尔托霍乱弧菌,噬菌体-生物分型结果其中均为9 L,分离自青蛙和牛蛙的8株霍乱弧菌的血清型为稻叶型,分离自养殖水的1株霍乱弧菌为小川型.结论 本次在水产品及其养殖水中检出霍乱弧菌,虽然检出的霍乱弧菌均为非流行株,但仍需加强监测,预防霍乱的散发和暴发流行.     

1起由O139引起的霍乱暴发调查

[目的]查找霍乱暴发的原因,分析其流行病学特征,为制订疫情控制措施提供科学依据.[方法]对2007年8月孝感市孝南区发生的1起霍乱暴发疫情进行调查.[结果]本起霍乱暴发疫情发生在家庭丧宴就餐者中,161人就餐,发病15例,发病率为9.32%;粪检161人,检出霍乱感染者11例,感染率为6.83%,其中3例为健康带菌者,无死亡病例.没有出现二代感染者.未聚餐者中未发现霍乱病人,粪检64人,均未检出霍乱弧菌.从11例感染者和1份厕所粪便检出的霍乱弧菌均为O139群.[结论]这是一起农家丧宴引起的O139群霍乱暴发.     

浙江省舟山市销售的水产品中霍乱弧菌污染状况调查

近年来在食源性霍乱暴发中由食用水产品引起的疫情占了较大比例,本文于2005年7-10月对舟山市销售的水产品中霍乱弧菌的污染和带病毒状况进行了调查。采用分层随机抽样,在舟山市定海、普陀两区的农贸市场和夜市大排档中采集314份水产品标本。标本采集后室温条件下1- 3 h内送检。试剂与仪器为碱性胨水、TCBS、4号琼脂、O1群和O139群霍乱诊断血清由浙江省疾病预防控制中心提供。     

扩增片段长度多态性分析用于霍乱弧菌分子分型的方法建立和应用评价

目的建立霍乱弧菌的基于红外荧光标记引物的扩增片段长度多态性(AFLP)分型方法,评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)和AFLP对霍乱弧菌的分型能力。方法选择PFGE带型均不相同的47株霍乱弧菌作为评价菌株,建立AFLP对于霍乱弧菌的分型方法;确定操作程序后选择83株分离自1962-2005年11个省的霍乱弧菌,进行AFLP和PFGE对于霍乱弧菌分型能力的比较。AFLP分型方法采用了红外荧光标记PCR引物,利用LI-COR4300自动测序仪完成电泳、SagaMX软件对电泳图谱进行编辑。PFGE采用PulseNet提供的标准化程序。结果AFLP用于霍乱弧菌分型时选择性引物携带碱基数为1,最优引物组合为EcoRⅠ-G／MseⅠ-T,AFLP分型实验的重复性达到99．2％。AFLP将83株霍乱弧菌分为52个型别,D值为0．9545;PFGE将此83株菌分为44种带型,D值为0．9251。结论优化固定了AFLP对于霍乱弧菌的分型程序,重复性好;AFLP比PFGE具有更好的分型能力,能够用于分离菌株的分子分型。结合已成为实验室网络监测标准分析方法的PFGE,可对分离株做更细致的分型比较。     

一株非产毒0139群霍乱弧菌的表型及基因型特性

2006年上海市从黄浦江水样中检测出一株霍乱肠毒素（CT）阴性的0139群霍乱弧菌，对其表型及基因型做了系统的鉴定，现将结果报道如下。     

The inherent characteristics and DNA polymorphism of Vibrio cholerae and other vibrios

Objective To investigate the inherent characteristics of Vibrio cholerae (V.cholerae) and other vibrios and their relationship.Methods Polymerase chain reaction (PCR), DNA sequence analysis, randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis and average linkage cluster analysis were used to study 3 isolates of V.cholerae strains O139, three isolates O1 biot ype El Tor, four isolates O1 biotype classical and 3 other vibrios.Results V.cholerae O139 contained the genomic sequences of ctx A2- B as well as V.cholerae O1.V.cholerae and others vibrios were divided into 4 groups by fingerprint patterns of RAPD, that is ① V.cholerae O139 and V.cholerae O1 El Tor; ② V.cholerae O1 classical; ③ V.para heamolyticus and V.vulnificus and ④ V.flluvialis.V.cholerae O139 DNA fingerprint of RAPD was consistent with the El Tor biotype: average linkage cluster distance was 0, and slightly different from the classical b iotype, with a distance of 2.07.It was much more different from vibrio par aheamolyticus and others, with a distance of 6.76-8.54Conclusion V.cholerae and other vibrios are polymorphic in inherent characteristics. The inherent characteristics of V.cholerae O139 are the same as El Tor b iotype.O139 may have evolved from the El Tor biotype.The inherent char acteristics of vibrio paraheamolyticus are the same as vibrio vulnificus.     

多联实时荧光PCR检测几种重要肠道致病菌的实验研究

目的建立一种能同时检测志贺氏菌(Sh)、O139霍乱弧菌(O139VC)和空肠弯曲菌(CJ)的多联实时荧光PCR定量方法。方法根据Sh的ipaH基因序列、O139VC的wbfR基因序列、CJ的c基因序列的开放读码框(orf),分别利用ABI primer experess 2.0和DNAStar中的Primer Select软件设计出数对特异性的引物和探针,筛选出最佳的各组引物和探针组合,对引物、探针的浓度、Mg2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化,从而建立了检测临床标本中Sh、O139VC和CJ的多联荧光PCR反应体系和检测方法。结果实验显示该方法具有特异性强,灵敏度高,均达到100copies/ml。结论多联实时荧光PCR方法可同时定量地检测临床标本中Sh、O139VC、CJ,结果显示快速简便,准确高效,有利于上述病原菌所致疾病的早期诊断和治疗。     

88株致病性弧菌科细菌的分离鉴定

致病性弧菌广泛分布于海水、淡水、海产品中，人类摄入或接触污染的水源和食物易引起感染。近年来有关致病性弧菌引起腹泻的报道逐渐增多。我们于2001年对部分市场水产品、河水、生活污水样品在进行O。群霍乱弧菌常规监测检验中，对O1群及O139群霍乱弧菌诊断血请不凝集者、动力阳性、氧化酶阳性、革兰阴性弧菌的菌株共88株，进一步作其它致病性弧菌的鉴定。现将结果报告如下：     

非可培养状态霍乱弧菌的间接免疫荧光检测

目的建立检测水中活的非可培养状态霍乱弧菌(O1群、O139群)的间接免疫荧光法。方法用本实验室人工转化的非可培养状态霍乱弧菌的菌液制成抗原片,用混合诊断血清(抗O1群、O139群)作为一抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记猪抗兔IgG作为二抗,进行间接免疫荧光检测。结果该方法可以成功检测出水中非可培养状态霍乱弧菌,其检测下限约为104cells/400 ml。结论该方法具有较好的特异性和灵敏度,可作为自然水体中非可培养状态霍乱弧菌的检测方法,用于霍乱弧菌的生态研究。