肿瘤坏死因子-α通过骨形态发生蛋白-2信号通路抑制成骨细胞分化的实验研究

目的 通过观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导鼠肌源细胞C2C12向成骨细胞分化过程中的影响,探讨TNF-α通过骨形态发生蛋白-2(BMP-2)信号通路对成骨细胞分化的调控及其规律.方法 应用BMP-2体外诱导鼠肌源细胞C2C12 向成骨细胞分化模型,实验分4组:对照组不做任何处理,BMP-2组放入100 ng/mL BMP-2,TNF-α组放入5 ng/mLTNF-α,BMP-2+TNF-α组放入100ng/mLBMP-2和5 ng/mL TNF-α.当BMP-2浓度保持100ng/mL时,添加TNF-α浓度为0、2、5、10 ng/mL;当TNF-α保持在5 ng/mL时,添加BMP-2浓度为100、200、300 ng/mL,分别进行培养7 d后,茜素红染色观察细胞矿化,4-硝基苯基磷酸二钠盐偶氮法定量分析成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 TNF-α组、BMP-2组和BMP-2+TNF-α组的成骨活性分别为0.260±0.245、7.311±0.772、1.344±0.133,组间两两比较差异均行统计学意义(P＜0.05).当BMP-2浓度保持100 ng/mL,TNF-α浓度为0、2、5、10 ng/mL时,ALP 活性分别为10.207±0.459、6.183±0.374、1.873±0.388、0.096±0.023,组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).当TNF-α保持在5 ng/mL,B MP-2浓度为100、200、300 ng/mL时,ALP活性分别为1.859±0.220、3.779±0.216、4.716±0.304,组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TNF-α能够抑制BMP-2诱导的成骨分化,并具有剂量-效应依赖相关性;且足量的BMP-2可以抵抗TNF-α对成骨细胞的抑制作用.     

阻断钙调磷酸酶/激活T细胞核因子通路对聚甲基丙烯酸甲酯颗粒抑制骨祖细胞向成骨细胞分化的影响

目的 探讨VIVIT肽阻断钙调磷酸酶(Cn)/激活T细胞核因子(NFAT)信号通路对聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)颗粒抑制骨祖细胞向成骨细胞分化的影响. 方法 体外分离培养Sprague-Drawley大鼠胎鼠颅骨原代细胞(包含大量骨祖细胞),根据处理条件不同分为4组:对照组、PMMA组、PMMA/VIVIT组和VIVIT组.细胞培养2、4、7和14 d用MTT法检测细胞增殖情况,7 d和14d用碱性磷酸酶(ALP)定量反映细胞分化;细胞培养14 d后菏素红染色观察细胞矿化,RT-PCR法观察ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原、Fra-2(与成骨细胞分化有关的转录因子)、NFATc1的基因表达,Western Blot法检测细胞核和细胞质中NFATc1蛋白的表达. 结果 PMMA组较对照组NFATc1基因和蛋白表达增加,并伴有NFATc1蛋白转位入核明显增加,成骨细胞分化、矿化和相关基因表达明显降低.PMMA/VIVIT组较PMMA组细胞分化、矿化和相关基因表达增加,但低于VIVIT组,NFATc1基因表达降低,转位入核的NFATc1蛋白明显减少.各组细胞增殖差异均无统计学意义(P>0.05). 结论 PMMA颗粒抑制骨祖细胞向成骨细胞分化与Cn/NFAT信号通路激活有关,VIVIT肽阻断Cn/NFAT信号通路可促进PMMA颗粒抑制的骨祖细胞向成骨细胞分化.     

含锶羟基磷灰石浸提液诱导骨髓基质干细胞成骨分化的研究

目的 探讨含锶羟基磷灰石(Sr-HA)对骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响.方法 从2只SD雄性大鼠双侧股骨、胫骨提取BMSCs.用含锶量分别为摩尔百分比为10%Sr-HA(A组)、5%Sr-HA(B组)、1% Sr-HA(C组)及不含锶的HA(D组)生物陶瓷粉末制备浸提液培养大鼠BMSCs.在培养的1、3、5、7、10 d检测各组BMSCs的增殖情况,于诱导培养后6、9、12及15 d检测各组BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性,于诱导培养后3、6、9及12 d检测各组BMSCs的核心结合因子α1(Cbfα1)基因表达.结果 A、B、C、D组细胞培养1、3、5、7、10 d四甲基偶氮唑盐(MTT)检测结果显示:各组间吸光度值差异均无统计学意义(P＞0.05),但同一组内不同时间点的吸光度值差异均有统计学意义(P＜0.05).细胞培养6 d时A、B、C、D组的ALP活性OD值分别为(0.061±0.005)、(0.058±0.003)、(0.056±0.005)、(0.055±0.005),从6 d起A组和B组ALP活性均显著高于C、D组,差异有统计学意义(P＜0.05).细胞培养9和12 d时各组Cbfα1 mRNA相对表达量两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HA中含锶量对BMSCs增殖无明显影响,但能促进BMSCs的成骨分化.     

破骨细胞分化过程中的信号通路及信号因子的研究进展

破骨细胞（osteoclast,OC）来源于骨髓,在生长发育过程中,起着骨吸收的重要功能,其增多或减少会引起骨质疏松或骨质硬化等相关的骨代谢性疾病。本文将从OC分化过程中所涉及的信号通路（NF-κB、Src-PI3K-Akt、MAPK、CN/NFAT、IDO/Tryptophan通路等）及相关信号因子（PU 1、 Lhx2、TNF-α、 M-CSF、TGF-β等）方面,对OC分化的信号通路及相关信号因子的研究进展进行简要综述,以期能为相关骨代谢性疾病的治疗提供新的思路。     

BrdU 标记家兔脂肪组织来源干细胞的体外研究

目的 通过采用 BrdU 标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stromal stem cells,ADSCs),检测其最佳标记时间、标记剂量及毒性作用,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性. 方法 8～12 周龄健康新西兰大白兔 6 只,雌雄不限,体重 1.5～2.0 kg.切取腹股沟皮下 1～2 mL 脂肪组织,采用贴壁法体外分离培养ADSCs,并进行鉴定.取第 3 代细胞以终浓度分别为5、10、15 和 20 μg/mL 的 BrdU 进行标记,分别记为A、B、C及 D 组;另 1 孔不含 BrdU,作为空白对照(E 组).标记12、24、48 和 72h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法行细胞计数观察标记后细胞活性. 结果 原代培养的ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞;传代后细胞形态主要为长梭形;第3代 ADSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化.免疫组织化学观察:第3代 ADSCs 经 BrdU 标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光.孵育 12h,A、B、C、D 组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为 30.6%±2.3%、32.4%±1.9%、45.8%±1.8%、50.8%±3.1%,C、D组与 A 组比较,差异有统计学意义(P<0.01);24 h,A、B、C及D组标记率分别为45.9%±2.0%、87.9%±3.3%、90.6%±2.9% 及 91.7%±3.2%;48 h 和 72 h,A、B、C、D 组标记情况与24 h 相似;E 组各时间点细胞标记阳性率为 0.孵育 24、48及72 h,B、C及D组细胞阳性率与 A 组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).孵育12、24、48 及 72 h细胞计数,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BrdU 标记 ADSCs 的最佳时间为 48 h,最佳浓度为 10μg/mL;BrdU 对细胞标记率及安全性高.     

流体剪切力对MC3T3-E1细胞OPG、RANKL蛋白表达的实验研究

目的探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下,两种调节骨骼重建的重要分子骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的蛋白表达情况。方法采用体外模型对MC3T3-E1细胞加载流体剪切力,细胞经不同时间加力后(0,30,60,90,120min),对细胞分别进行染色和裂解,运用免疫荧光和蛋白印迹法对OPG和RANKL的蛋白表达水平进行定量分析。结果 FSS作用30,60,90,120min后能够显著增加OPG的蛋白表达(P0.05),减少RANKL的蛋白表达(P0.05)。两者共同作用使得OPG/RANKL值显著增高(P0.05)。结论流体剪切力刺激提示OPG/RANKL的比值可能在成骨细胞和破骨细胞联合调节骨骼形成和吸收的过程中起着重要的调节作用。     

绝经前、后子宫内膜癌患者病理特点、细胞分化及预后比较

目的研究绝经前、后子宫内膜癌患者病理特点、细胞分化及预后。方法回顾性分析2008年1月至2010年7月于周口市中医院就诊的102例子宫内膜癌患者临床病历资料,其中绝经前患者44例,绝经后患者58例。比较两组患者临床病理特点、细胞分化程度及预后。结果绝经前组患者例数显著低于绝经后组(P<0.05),绝经前组非子宫内膜样腺癌、组织学分级为Ⅱ、Ⅲ级及无宫颈浸润患者例数显著少于绝经后组(P<0.05),而中高分化和肌层浸润深度小于1/2患者例数显著多于绝经后组(P<0.05)。绝经前组发生淋巴结、宫颈、附件及多器官转移的例数均少于绝经后组,但差异无统计学意义(P>0.05)。绝经前组5年生存率为88.64%,绝经后组为87.93%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论子宫内膜癌好发于绝经后女性,且绝经后女性患者细胞分化程度低,恶性程度高,预后较差。但子宫内膜癌发病有年轻化趋势,临床应警惕月经紊乱等子宫内膜癌的早期症状,早期诊断,及时干预治疗,可获得较好预后。     

特立帕肽通过cAMP/PKA/CREB信号通路调控高糖微环境下的成骨细胞分化

目的 探讨特立帕肽对高糖微环境下小鼠胚胎成骨细胞（MC3T3-E1）分化的影响及作用机制。方法 将MC3T3-E1细胞分为正常糖组（NG,5.5 mmol/L葡萄糖）、NG+特立帕肽组（5.5 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L特立帕肽）、高糖组（HG,25 mmol/L葡萄糖）、HG+特立帕肽组（25 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L特立帕肽）和HG+特立帕肽+PKA抑制剂组（25 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L特立帕肽+20μmol/L H-89）。CCK-8法检测细胞增殖;ELISA实验检测各组cAMP水平;试剂盒检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色检测细胞矿化结节生成情况;鬼笔环肽染色后观察细胞骨架;Real-time PCR检测细胞中PKA、CREB、RUNX2和Osx的mRNA表达水平。结果 各组细胞增殖能力差异无统计学意义（P>0.05）。与NG组相比,NG+特立帕肽组细胞cAMP水平升高（P<0.05）,ALP活性增强（P<0.05）,茜素红矿化结节生成能力增强（P<0.05）,细胞骨架清晰程度有所提升,PKA、CREB、R...