人骨髓间质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间质干细胞（MSC）在体外培养条件下能否定向诱导分化为表皮细胞。方法抽取无造血系统恶性疾病的成人骨髓标本，采用Percoll细胞分离液（1．073g／ml）分离MSC，在体外传代培养至第3代，分为对照组和实验组。两组分别用普通L-DMEM培养基和含表皮生长因子、胰岛素、维甲酸、氯化钙的L-DMEM培养基诱导7d。在倒置相差显微镜下每天观察两组细胞的形态；采用免疫组织化学法检测P63和广谱细胞角蛋白（PCK）的表达情况。结果实验组细胞由长梭形逐渐转变为扁圆形或形态不规则，部分细胞P63和PCK呈阳性表达；对照组细胞持续呈长梭形，P63和PCK未见表达。结论人骨髓MSC在体外可诱导分化为表皮细胞。     

11β羟化类固醇脱氢酶1与成骨细胞分化之间相互关系的研究

目的 通过体外地塞米松刺激原代大鼠成骨细胞分化,观察11β羟化类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）在成骨细胞分化中的变化以及相关成骨基因的表达情况,探讨11β-HSD1与成骨细胞分化之间关系以及可能的作用机制.方法 采用酶消化法获得大鼠成骨细胞,建立地塞米松（Dex）药物刺激模型（Dex组1×10-8 mol/L和正常对照组）,分别于培养0、2、4、6、8、10 d抽提RNA行RT-PCR和蛋白行Western Blot,检测成骨细胞相关基因和11β-HSD1的表达情况.结果 11β-HSD1在正常成骨细胞中随着培养表达逐渐升高,在Dex刺激组中成骨细胞分化指标ALP、COLⅠ较对照组明显升高,伴有11β-HSD1 mRNA和蛋白水平的下调.结论 在成骨分化过程中,11β-HSD1表达下降,与分化呈逆相关.11β-HSD1可能通过自分泌的方式参与调节成骨细胞的分化.     

吗替麦考酚酯抑制小鼠TH17细胞的分化和增殖

目的 通过观察吗替麦考酚酯(MMF)对小鼠辅助性T淋巴细胞17(TH 17细胞)分化和增殖的影响,探讨MMF的免疫抑制作用及其机制.方法 采用随机数字表法将小鼠分为MMF组与对照组,每组8只.MMF组小鼠每天给予MMF 40 mg·kg-1·d-1灌胃,对照组小鼠每天给予等体积生理盐水灌胃.3周后取小鼠外周血和脾脏,采用流式细胞术检测小鼠外周血和脾细胞中TH17细胞和CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Treg细胞)的比例,并计算出TH 17细胞与Treg细胞的比值;采用酶联免疫吸附试验法分别检测两组小鼠血清中白细胞介素(IL)-17和IL-23的浓度.结果 MMF组外周血和脾细胞中TH17细胞比例分别为(1.95±0.08)％和(2.42±0.06)％,对照组分别为(3.19±0.07)％和(4.21±0.25)％,两组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).MMF组外周血和脾细胞中TH 17细胞与Treg细胞的比值均显著低于对照组(P＜0.05).MMF组小鼠血清IL-17水平明显低于对照组(P＜0.05),而血清IL-23水平高于对照组(P＜0.05).结论 MMF能够明显抑制小鼠体内TH17细胞的分化与增殖,降低TH 17细胞与Treg细胞的比值,减少IL-17的分泌,有利于诱导免疫耐受.     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用

目的：观察成骨生长肽诱导体外培养的大鼠骨髓基质细胞增殖及向成骨分化的作用。方法：取6周龄SD大鼠，贴壁法分离培养骨髓基质细胞，在不同浓度成骨生长肽的诱导下，观察细胞形态变化，绘制骨髓基质细胞生长曲线，碱性磷酸酶和钙结节组织化学染色。结果：成骨生长肽对骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用呈剂量依赖性：成骨生长肽浓度在10^-10及10^-11mol／L时促进骨髓基质细胞增殖，而在10^-8及10^-9mol／L时对骨髓基质细胞的增殖略有抑制作用；成骨生长肽浓度在10^-10及10^-11mol／L时骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色基本呈阴性，与对照组相比差异无统计学意义，而在10^-8及10^-9mol／L浓度下可以显著提高骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色的阳性率。结论：成骨生长肽可以明显促进大鼠骨髓基质细胞增殖及向成骨细胞分化，其促成骨活性具有显著的浓度依赖性。     

TGF-β1和IGF-1共同转染大鼠BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路. 方法 6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150 g.扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序.采用密度梯度离心法和贴壁分离法,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志.将TGF-β1和IGF-1基因单独或共转染第3代BMSCs,按转染情况分为5组未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF-β1组(C组)、转染IGF-1组(D组)、TGF-β1与IGF-1共转染组(E组).对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达. 结果 电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符.大鼠BMSCs原代细胞接种24 h后可见少量贴壁突起细胞,4、5 d开始形成典型的BMSCs簇状增生,9、10 d细胞生长即可达80%～90%融合;传代后细胞形态较均一.免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应.转染24 h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞克隆形成,至第4周细胞可传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显.MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,分别为0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655 ±0.045和0.833 ±0.103.A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P＜0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR和Westernblot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.925 ±0.0220、124.341 7 ±2.982 0,E组次之,分别为0.771 7±0.012 0、101.766 7±1.241 0(P＜0.01);IGF-1表达以E组最多,分别为1.0200±0.026 0、128.171 7±9.152 0,D组次之,分别为0.465 0 ±0.042 0、111.045 0 ±6.248 0(P＜0.01);Ⅱ型胶原表达以E组最多,分别为0.980 0 ±0.034 0、120.355 0 ±12.550 0,C组次之,分别为0.720 0 ±0.026 0、72.246 7 ±7.364 0(P＜0.01). 结论 通过TGF-β1和IGF-1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义.     

BrdU 标记家兔脂肪组织来源干细胞的体外研究

目的 通过采用 BrdU 标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stromal stem cells,ADSCs),检测其最佳标记时间、标记剂量及毒性作用,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性. 方法 8～12 周龄健康新西兰大白兔 6 只,雌雄不限,体重 1.5～2.0 kg.切取腹股沟皮下 1～2 mL 脂肪组织,采用贴壁法体外分离培养ADSCs,并进行鉴定.取第 3 代细胞以终浓度分别为5、10、15 和 20 μg/mL 的 BrdU 进行标记,分别记为A、B、C及 D 组;另 1 孔不含 BrdU,作为空白对照(E 组).标记12、24、48 和 72h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法行细胞计数观察标记后细胞活性. 结果 原代培养的ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞;传代后细胞形态主要为长梭形;第3代 ADSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化.免疫组织化学观察:第3代 ADSCs 经 BrdU 标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光.孵育 12h,A、B、C、D 组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为 30.6%±2.3%、32.4%±1.9%、45.8%±1.8%、50.8%±3.1%,C、D组与 A 组比较,差异有统计学意义(P<0.01);24 h,A、B、C及D组标记率分别为45.9%±2.0%、87.9%±3.3%、90.6%±2.9% 及 91.7%±3.2%;48 h 和 72 h,A、B、C、D 组标记情况与24 h 相似;E 组各时间点细胞标记阳性率为 0.孵育 24、48及72 h,B、C及D组细胞阳性率与 A 组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).孵育12、24、48 及 72 h细胞计数,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BrdU 标记 ADSCs 的最佳时间为 48 h,最佳浓度为 10μg/mL;BrdU 对细胞标记率及安全性高.     

BMP—2对培养兔关节软骨细胞代谢的影响

目的：探讨BMP－2对体外培养兔关节软骨细胞代谢影响进而了解其在关节软骨损伤修复中的作用。方法：利用荧光分光光度计,721－型分光光度计,^S-Na2SO4同位素掺入法等测定DNA含量、胶原和蛋白多糖的合成。结果：BMP－2既能促进原代及反分化关节软骨细胞DNA合成又能增加羟脯氨酸的含量^35S-Na2SO4掺入。结论：ＢＭＰ－２能促进软骨细胞的增殖和维持其表型,还可使已丢失软骨表型的反分化软骨细胞有向恢复软骨表型方向分化的可能。     

透明质酸对BMP-2转染的羊BMSCs增殖、分化的影响

目的观察透明质酸（HA）对携带人骨形态发生蛋白-2的腺病毒（Adv-BMP-2）转染的羊骨髓基质干细胞（BMSCs）体外增殖、分化的影响。方法将羊骨髓体外分离、扩增BMSCs,分成5组：转染Adv-BMP-2的BMSCs＋HA组（Ⅰ组）,转染Adv-BMP-2的BMSCs组（2组）,BMSCs＋HA组（3组）,BMSCs组（4组）,转染携带β半乳糖苷酶的腺病毒（Adv-β-gal）的BMSCs组（5组）。采用细胞计数、绘制细胞生长曲线和流式细胞分析观测细胞增殖;采用碱性磷酸酶（ALP）检测以及RT-PCR检测Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨连接素（ON）和骨涎蛋白（BSP）的mRNA表达。结果①细胞增殖：3 d后各组细胞增殖无显著差异,1周后第1组和第3组的细胞增殖明显高于其他组。②ALP活性：3 d后第3组ALP活性明显低于第4、5组,而第1、2组则显著高于第4、5组;7 d后前3组ALP活性较后两组均显著增加,而第1、2组ALP活性增加更为显著。③Col-Ⅰ、ON和BSP的mRNA表达：3 d和7 d后前3组较后两组均有不同程度的增多。结论HA与BMSCs体外复合培养后可促进BMSCs的增殖、增加ALP的活性以及Col-Ⅰ、ON和BSP基因的表达。     

间充质干细胞用于慢性创面治疗的作用途径及其相关机制

<正>间充质干细胞(MSCs)是一类存在于大多数成体器官中的类成纤维细胞群,在特定条件下能够向不同的谱系细胞分化。Falanga等[1]将MSCs与造血细胞共同培养,发现MSCs可以促进造血干细胞的增殖,提示MSCs具有分泌生物活性因子并调节其他细胞功能的能力。MSCs在进入创面或是其他损伤组织时会被激活,起到促进创伤愈合和改善局部缺血的作用。目前MSCs作用于创面的机制尚未完全清楚,但MSCs在调节免疫应答和免疫排斥反应方面的功能,以及在促     

丹参酮ⅡA对人胎盘间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导作用及其机制

目的：探讨丹参酮ⅡA （TanⅡA）对人胎盘间充质干细胞（hPDMSCs）向心肌细胞分化的诱导作用及其机制,为TanⅡA作为心肌细胞分化诱导剂提供实验依据。方法：采用不同浓度TanⅡA （0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg·L^-1）处理hPDMSCs,MTT法筛选出无毒剂量的TanⅡA （0.1 mg·L^-1）用于实验。hPDMSCs培养体系分为对照组、5-氮胞苷（5-aza,10μmol·L^-1）诱导组和TanⅡA （0.1 mg·L^-1）诱导组。培养20d后,免疫组织化学法检测各组细胞中α-横纹肌肌动蛋白（α-SCA）的表达;免疫荧光法检测各组细胞中心肌肌钙蛋白I （cTnI）的阳性表达率,计算心肌细胞分化率;Western-blotting法检测各组细胞中心肌转录调节因子4（GATA4）、心钠素（ANF）、cTnI、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）和β-连环蛋白（β-catenin）的蛋白表达水平。结果：hPDMSCs的生物学特性符合间充质干细胞。MTT法,当TanⅡA浓度大于0.1 mg·L^-1时,细胞存活率随浓度的增加而降低。对照组细胞在培养12 d以前呈快速增长趋势,培养12 d后细胞增殖活性降低;与对照组比较,5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。免疫组织化学染色,对照组细胞不表达α-SCA,5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞均表达α-SCA,且TanⅡA诱导组更明显。与对照组比较,5-aza诱导组和TanⅡA诱导组细胞中GATA4（t_5-aza=2.937,P_5-aza<0.05;t_TanⅡA=4.769,P_TanⅡA<0.05）、ANF （t_5-aza=3.728,P_5-aza<0.05;t_TanⅡA=5.912,P_TanⅡA<0.05）、cTnI （t_5-aza=3.623,P_5-aza<0.05;t_TanⅡA=7.153,P_TanⅡA<0.05）和GSK-3β（t_5-aza=2.995,P_5-aza<0.05;t_TanⅡA=5.420,P_TanⅡA<0.05）蛋白表达水平明显升高,β-catenin （t_5-aza=2.985,P_5-aza<0.05;t_TanⅡA=6.951,P_TanⅡA<0.05）蛋白表达水平明显降低;与5-aza诱导组比较,TanⅡA诱导组GATA4、ANF和GSK-3β蛋白表达水平进一步升高（P<0.05）。结论：TanⅡA能诱导hPDMSCs分化为心肌细胞,且效果优于5-aza,其机制可能与TanⅡA能抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。