海胆黄多糖SEP纯化工艺的研究

为了规模化制备具有抗肿瘤活性的海胆黄多糖(SEP),简化纯化步骤和提高多糖收率,在原有分离纯化方法的基础上,结合超滤技术,对SEP的纯化工艺进行了优化。采用木瓜蛋白酶-Sevag联用法,以超滤法替代减压浓缩和透析去除杂质,优化酶法提取条件和超滤参数。研究结果表明:用0.6%的木瓜蛋白酶在pH 6.5、60℃酶解5 h,可去除18.3%的蛋白质,3次Sevag法后,蛋白质去除率达71.7%,多糖回收率80.1%。采用截留相对分子质量100 k的膜超滤浓缩,压力0.05 MPa,原液质量浓度1.2 mg/mL,浓缩3倍时的多糖截留率为84.0%。各步骤多糖累计回收率为67.3%,该纯化工艺可获得高产率高纯度的SEP,为规模化制备SEP奠定了基础。     

4种检测IgG红细胞抗体方法的比较

目的比较木瓜蛋白酶、抗球蛋白实验、聚凝胺和微柱凝胶4种检测IgG红细胞抗体方法的特异性、敏感性、效价及所需时间.方法将12种IgG抗体:抗-D、抗-E、抗-C、抗-c、抗-e、抗-Jka、抗-Jkb、抗-Fya、抗-Fyb、抗-k抗-S、抗-s分别采用上述4种方法检测.结果木瓜蛋白酶检出了抗-D、抗-E、抗-C、抗-c、抗-e、抗-Jka、抗-JKb7种抗体(7/12);抗球蛋白试验检出了所有12种抗体(12/12);聚凝胺法检出了除抗-k以外的抗体(11/12);而微柱凝胶也检出了所有12种抗体(12/12).木瓜蛋白酶检测Rh及Kidd血型系统的抗体效价低于其它3种方法,而微柱凝胶检测这12种抗体效价较其它3种方法更为敏感.4种方法检测IgG抗体所需时间分别为:木瓜蛋白酶45min,抗球蛋白实验60min,聚凝胺5 min,微柱凝胶30 min.结论木瓜蛋白酶检测IgG抗体具有一定的局限性;抗球蛋白实验因需要反复洗涤红细胞费工费时;聚凝胺是目前最快速简便检测IgG抗体的方法;而微柱凝胶是检测IgG抗体最为敏感的方法.     

木瓜蛋白酶结合运动装置建立兔膝关节创伤性滑膜炎模型的实验研究

目的:探讨木瓜蛋白酶联合运动装置建立膝关节创伤性滑膜炎动物模型的方法.方法:将10只新西兰兔随机分为空白组和模型组,每组各5只.从造模实验开始的第1、4、7天将0.1 ml 4％的木瓜蛋白酶水溶液注射于模型组兔的右后肢关节腔内,第8天开始,将模型组麻醉后,将其四肢固定于运动装置上继续造模,共造模7 d.测量兔造模肢膝关...     

酶法提取平菇多糖工艺研究

目的 研究酶法提取平菇多糖的最佳工艺.方法 在单因素试验的基础上,采用正交试验分别研究木瓜蛋白酶和纤维素酶提取平菇多糖的最佳工艺条件.结果 木瓜蛋白酶提取平菇多糖的最佳工艺条件是:酶质量分数0.5％,酶解温度50℃,pH6,酶解反应1h;纤维素酶提取平菇多糖的最佳工艺条件是:酶质量分数0.5％,酶解温度55℃,pH7,酶解反应1h.结论 在此条件下,木瓜蛋白酶和纤维素酶提取平菇多糖的得率分别为18.67％和18.52％.     

响应面法优化西番莲果皮中可溶性膳食纤维的酸酶法提取工艺

目的:优选西番莲果皮中可溶性膳食纤维的提取工艺,为其功能食品的研发提供参考。方法:在单因素试验基础上,选择柠檬酸溶液质量分数、料液比、耐高温α-淀粉酶添加量、复合酶反应温度为自变量,西番莲果皮可溶性膳食纤维提取量为因变量,利用Box-Behnken响应面法优选提取工艺参数。结果:最佳工艺条件为料液比1∶40,耐高温α-淀粉酶添加量5.0 U·g-1,柠檬酸溶液质量分数0.18%,复合酶反应温度80℃。可溶性膳食纤维提取率13.82%,与预测值的相对偏差-6.56%。结论:采用响应面法优化的西番莲果皮中可溶性膳食纤维提取条件稳定可靠,具有一定的实用价值。     

酪蛋白抗凝血肽的制备及其体外抗凝血、溶栓作用研究

目的研究抗凝血肽的制备、分离方法及其体外抗凝血、溶栓效果。方法用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶对酪蛋白进行4酶混合水解制备抗凝血肽,以固定化凝血酶对抗凝血肽进行萃取,用新西兰兔进行体外抗凝血、溶栓实验。结果实验确定的抗凝血肽制备条件为酪蛋白质量浓度15%,水解每克酪蛋白的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶用量分别为1 500、2 400、1 000、1 250 U,水解温度50℃,pH 7.0,水解时间4 h。固定化凝血酶萃取抗凝血肽的初始浓度6 ATU/mL,萃取温度30℃,pH 5.0,萃取时间30 min。反萃取温度30℃,pH 7.6,反萃取时间40 min。抗凝血肽经高效体积排阻色谱分析,主要成分分子大小与马尿酰-组氨酰-亮氨酸相当。体外抗凝血时间超72 h,溶栓时间24 h。结论酪蛋白抗凝血肽主要成分为3肽,体外抗凝血及溶栓实验效果良好。     

犬肺气肿模型的制作

目的:探讨大动物肺气肿模型制作方法。方法:选 16只健康杂种犬,随机均分为 2组。应用木瓜蛋白酶行气管内注入及雾化吸入 2种方法,呼吸机过度通气诱导,每种方法分单、双侧肺 2种情况 (各 4只犬 )。诱导后1~3周行大体标本观察,测量肺体积,病理学检查肺组织结构。结果: 2种方法所制的肺气肿模型肺组织表面均可见肺大泡形成,病理学检查:肺组织结构破坏,肺泡融合成肺大泡。模型肺体积与正常肺体积比较差异有统计学意义(P<0. 001)。雾化吸入法各叶肺组织呈均质型肺气肿改变,注射法各叶肺组织呈非均质型肺气肿改变。双腔气管插管单侧用药,用药侧肺组织呈均质型及非均质型肺气肿改变,对侧肺组织结构正常。结论:木瓜蛋白酶加呼吸机过度通气,能快速诱导大动物肺气肿模型。不同方法能够诱导出不同类型肺气肿模型。     

抗体Fc片段的离子交换法制备和印渍法鉴定

免疫球蛋白经羧甲基纤维素(CM22)柱交换,并用增加盐浓度分段洗脱,可分得4个蛋白峰。其中,用0.1M醋酸钠缓冲液洗脱出的3个蛋白峰具Fc性质,而用0.225M醋酸钠缓冲液洗脱的蛋白质不与葡萄球菌A蛋白(SPA)相结合。将具Fc性质的组分合并,由木瓜蛋白酶消化后,各蛋白质片段再经CM22柱分段洗脱,得到5个蛋白峰。分离出的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至滤膜上。膜上各蛋白质用SPA-HRP探针作酶分析,从而鉴定IgG的Fc片段。实验提示,0.225M醋酸钠缓冲液洗脱出的蛋白蜂是抗体Fc片段。     

不同来源木瓜蛋白酶合成Aspartame前体能力的研究

研究了Ｓｉｇｍａ公司、Ｍｅｒｃｋ公司和广州远天酶制剂厂生产的木瓜蛋白酶和从木瓜青果中提取的木瓜蛋白酶在水－乙酸乙酯两相反应系统中合成二肽甜味剂Ａｓｐｅｒｔａｍｅ前体（Ｐ－ＡＰＭ）的能力，并以ＨＰＬＣ（流动相为乙腈－水＝４５：５５，检测波长２６０ｎｍ，流速１ｍｌ／ｍｉｎ）和ＴＬＣ（硅胶ＧＦ＿（２５４）板，展开剂为正丁醇－醋酸－水＝３：１：１，显色剂为１％茚三酮丙酮液）对Ｐ－ＡＰＭ进行检测，实验结果表明，Ｐ－ＡＰＭ与以嗜热蛋白酶催化合成的Ａｓｐａｒｔａｍｅ中间产物极为相似。不同来源的木瓜蛋白酶由于其酶活力不同，对Ｐ－ＡＰＭ的合成和水解能力也有差异，选择国产的木瓜蛋白酶合成Ａｓｐａｒｔａｍｅ，为酶法合成二肽甜味剂提供了可探讨的途径。     

木瓜蛋白酶与石膏制动建立兔膝骨关节炎模型的比较

目的 比较木瓜蛋白酶关节腔注射与关节石膏伸直位制动建立兔膝骨关节炎模型的效果.方法 将21只实验兔采用随机区组分组法分为正常组、木瓜蛋白酶组及石膏组,每组7只.木瓜蛋白酶组予6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液于实验开始第1、4、7天行右膝关节腔注射,注射结束4周后造模完成;石膏组予膝关节伸直位固定6周;记录实验期间动物不良情况发生率,造模完成后处死实验兔,取软骨标本进行大体观察、Pelletier评分、Mankin′s评分,免疫组化测定软骨Ⅱ型胶原蛋白含量, ELISA法检测血清和关节液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)以及基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的含量.结果 大体观察显示木瓜蛋白酶组与石膏组均出现关节肿胀、关节间隙变窄、软骨缺损、滑膜增生硬化、炎症改变、骨赘形成;Pelletier 评分、Mankin′s 评分、Ⅱ型胶原蛋白含量、血清和关节液中TNF-α、COMP以及MMP-3的含量,木瓜蛋白酶组、石膏组与正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);木瓜蛋白酶组与石膏组比较,上述指标差异均无统计学意义(P>0.05).木瓜蛋白酶组动物不良情况发生率明显低于石膏组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 木瓜蛋白酶关节腔注射与石膏关节伸直位制动均能成功建立膝骨关节炎模型,但木瓜蛋白酶关节腔注射法更为快捷、简便,并发情况少,可行性好.