RNA干扰技术及其在大肠癌研究中的应用

RNA干扰是指生物体内利用双链RNA（dsRNA）诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,导致转录后基因沉默的现象。近年来RNAi技术在医学研究中的广泛应用取得了显著的基因沉默效果,并以其高效、特异等显著优势成为研究基因功能的新手段。大肠癌的恶性度高,发展迅速,治疗困难,病死率高,其发生发展涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活及突变,以及凋亡相关基因的异常表达等过程,多数伴有大量基因的过度表达。本文就RNAi的作用机制、特点及其在大肠癌研究中的应用作一综述。     

基因治疗病毒载体的研究进展

基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征（SCID—X1）患者的治疗,已走过了十几个年头,给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折,比如近来发现经基因治疗的SCID—X1患者之一出现了类白血病反应,可能是基因随机整合染色体所致,使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素,主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时间短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体,各种病毒载体有自身的利弊,     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展

基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其他难治性疾病的有效手段,但目前基因转移方法的局限性成为实现这一愿望的最大障碍.慢病毒(LV)属于逆转录病毒属的一个亚科,其中包括灵长类LV如人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)、HIV-Ⅱ、猴免疫缺陷病毒(SIV)和非灵长类LV如Visna病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)等7个亚属.     

TIMP-3基因转染血管平滑肌细胞移植对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响

目的 研究基质金属蛋白酶组织抑制因子3 ( tissue inhibitor-3 of matrix metalloproteinases,TIMP-3) 基因转染血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs) 移植, 对急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI) 后早期心脏功能变化的影响, 并探讨其可能的机制.方法 取Wistar大鼠胸主动脉,采用组织块贴壁法培养VSMCs.采用左冠状动脉远端结扎的AMI动物模型,随机分3组.于冠状动脉结扎后立即向缺血部心室壁内注射含有1×106 个TIMP-3基因转染的VSMCs (A组)、1×106 个VSMCs(B组)或不含细胞的DMEM液(C组),各0.5ml.术后3天, 进行心脏功能学检测观察大鼠心脏功能变化,免疫组化染色验证TIMP-3 基因转染VSMCs在缺血心肌中的存活情况,RT-PCR法测定缺血心肌TIMP-3和基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP-9) mRNA含量.结果 分离、培养的VSMCs纯度达98% ,TIMP-3基因成功转入VSMCs 中.术后3天,A组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值较正常鼠升高(P<0.05),但小于B(P<0.01)组和C组(P<0.01).A组的FS和EF值较正常组有所下降(P<0.01),但大于B和C组(P<0.01).免疫组化染色见TIMP-3基因转染VSMCs被成功种植缺血心肌并在其中存活.RT-PCR结果显示:各移植组TIMP-3 mRNA含量均较对照组显著升高(P<0.01),A组较B组、C组明显增高(P<0.01);A组MMP-9 mRNA含量较B组、C组明显降低(P<0.01).结论 将TIMP-3基因转染的VSMCs 移植入心肌缺血区可明显抑制MMP-9的表达,进而抑制AMI后早期心肌重塑,改善心功能.     

由mTERT启动子驱动m4-1BBL基因的腺病毒载体的构建

目的构建由具有肿瘤特异性启动作用的端粒酶逆转录酶启动子（mTERT-promotor）驱动m4-1BBL（CD137Ligand）基因的腺病毒载体。方法用PCR和RT-PCR的方法,分别从C57BL/6小鼠组织中克隆mTERT启动子和共刺激分子m4-1BBL基因,通过T载体和转移载体将目的基因亚克隆到腺病毒载体上,293A细胞包装成病毒颗粒rAD-mTERT-m4-1BBL,流式细胞仪检测m4-1BBL基因在Hepa1-6及L929细胞上的表达。结果通过PCR检测、直接测序证实目的基因克隆成功并亚克隆到表达载体上,细胞免疫化法证实病毒包装成功,流式细胞仪检测发现重组腺病毒载体rAD-mTERT-m4-1BBL能特异性地在肿瘤细胞Hepa1-6上高表达m4-1BBL。结论由mTERT-promotor驱动m4-1BBL基因的具有肿瘤特异性的腺病毒载体构建成功,为下一步进行体内外抗肿瘤实验打下了基础。     

uPAR反义RNA质粒对胶原型大鼠滑膜细胞外基质影响的初步研究

目的：初步探讨uPAR反义RNA表达质粒对CIA大鼠滑膜细胞外基质的影响。方法：50只雌性大鼠,其中10只为正常对照组,不做任何处理,其余40只建立Ⅱ型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎模型,分为4组,每组10只,为造模对照组、生理盐水治疗组、空质粒治疗组、重组质粒治疗组,后3组踝关节分别注射生理盐水、空质粒及uPAR反义RNA表达质粒,观察大鼠一般情况、关节炎指数,病理变化及免疫组织化学法检测踝关节滑膜uPAR、MMP-3的表达。结果：随着CIA免疫时间的延长,造模对照组、生理盐水治疗组、空质粒治疗组关节炎指数评分逐渐增加迅速,而重组质粒治疗组关节炎指数评分增加缓慢;与正常对照组比较,模型组大鼠滑膜,滑膜轻度增厚,滑膜新生血管开始增多,大量炎性细胞浸润、增生,免疫组织化学显示：模型对照组、生理盐水组及空质粒组之间无统计学意义（P〉0．05）,模型对照组、生理盐水组、空质粒组与重组质粒治疗组之间差异有统计学意义（P〈0．01）,MMP-3的表达正常大鼠与模型对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）,模型对照组与重组质粒治疗组之间差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：uPAR反义RNA表达质粒能抑制细胞外基质的降解,为类风湿性关节炎的治疗提供理论依据。     

肝癌各种治疗方法的护理

原发性肝癌是一种常见且难治的恶性肿瘤,据统计全球每年死于肝癌约50万人,其中 42.5%发生在我国.目前肝癌总的5年生存率仍然很低,严重危害着人民的健康和生命,因此对此类患者的治疗研究具有重大的社会意义[1].近年来,肝癌的治疗方法常见的有手术、TACE、放疗等,本中心常用的有经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)、立体定向放疗、TACE联合立体定向放疗、p53基因治疗等方法.     

细胞因子在椎间盘源性疼痛中的作用及其机制

学术背景：椎间盘源性疼痛是慢性腰背痛的一个主要原因,其炎性机制的作用越来越受到人们的重视。在炎症机制里有许多细胞因子参与,这些细胞因子在疼痛的发生、发展中起着怎样的作用,应如何利用这些细胞因子来治疗疼痛,说法不一。 目的：全面认识椎间盘突出的发病机制,认识各种细胞因子在疾病发生发展中的作用以及利用细胞因子治疗慢性疼痛的进展。 检索策略：应用计算机检索CNKD期刊全文数据库医药卫生类1994-01/2007-06关于椎间盘源性疼痛方面的文献,检索词“生物因子,疼痛”,限定文献语言种类为中文,获得文章153篇。同时计算机检索PubMed数据库2002-01/2007-06关于椎间盘源性疼痛方面的文章,检索词“gene,chronic pain”,限定文献语言种类为English,获得文章36篇。检索应用CAJViewer6.0软件。对资料进行初审,纳入标准：从基础到临床与细胞因子密切相关的文章。排除标准：重复性研究。对所得文献进行提炼,按上述标准纳入中文6篇,英文24篇。 文献评价：30篇文章中10篇侧重于基础研究和动物实验,20篇为临床研究文献。其中RCT文章7篇,循证医学系统综述1篇、汇总分析10篇、个例报道2篇、经验交流10篇。 资料综合：椎间盘源性疼痛除传统的机械压迫外,还包括炎症机制和免疫机制。炎症机制在椎间盘源性慢性疼痛中的作用越来越受到重视,其中有P物质、磷脂酶A2、肿瘤坏死因子、白细胞介素、生长因子、一氧化氮等多种细胞因子参与。免疫机制的作用也不容忽视。了解了慢性疼痛的发生机制,进而将白细胞介素1受体拮抗剂、血管内皮生长因子等应用于临床,疗效显著,应用前景广阔。 结论：疼痛的发生以及对于镇痛药物的不同反应有其一定的基因基础,细胞因子在椎间盘源性疼痛的发生、发展以及治疗中都起着非常重要的作用。     

靶向p38丝裂素活化蛋白激酶对兔唇裂术后瘢痕增生的影响

目的研究运用p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）基因重组腺病毒靶向敲低目的基因的表达,通过检测p38MAPK信号通路受到抑制后不同时间段兔上唇瘢痕增生受到的影响,来探讨疗效最佳的基因治疗时间。 方法对90只2.0~2.5 kg的上唇裂新西兰白兔进行唇裂修复术,选取术后第0、1、2周对其瘢痕正中注射重组病毒,将第3周的瘢痕组织制成标本。通过使用蛋白免疫印迹法（Western blot）、实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学染色等方法分别定性、定量检测p38MAPK及瘢痕形成相关因子与Smad蛋白和mRNA的相对表达水平。使用SPSS 24.0软件对实验结果进行统计学分析。 结果相较于术后第0、2周,术后第1周瘢痕组织中ColⅢ（1.373 ± 0.073,F = 8.027,P = 0.002）、MMP1（1.715 ± 0.028,F = 9.262,P = 0.001）表达明显升高,ColⅠ（0.424 ± 0.015,F = 7.794,P = 0.003）和TIMP1（0.464 ± 0.025,F = 6.196,P = 0.007）表达明显降低,差异均有统计学意义。术后第1周的Smad2蛋白表达水平与mRNA表达水平降低（F = 14.123,P = 0.029）,Smad3蛋白表达水平与mRNA表达水平降低（F = 3.796,P = 0.037）,与其他组相比差异均有统计学意义。 结论抑制p38MAPK表达可能通过Smad依赖型信号通路发挥抑制瘢痕增生的作用,兔上唇唇裂术后第1周瘢痕形成过程中靶向敲低p38MAPK对瘢痕增生影响最大。