NucliSens HIV-1 QT和Amplicor HIV-1 monitor1.5方法测定HIV-1病毒载量的比较研究

目的进行NuchSens HIV-1 QT和Amplicor HIV-1 monitor 1．5检测相同临床样品HIV-1病毒载量值之间的比较研究。方法收集临床样本82份，使用两种方法测定病毒载量，对病毒载量值进行统计分析。结果未测到核酸的和两种方法病毒载量对数值之差小于0．5的占88．9％；用△log10 VL〈0．5的56份样本统计两种方法的相关性，相关系数为0．956。结论NucliSens HIV-1 QT和Amphcor HIV-1 monitor 1．5两种方法测定的HIV病毒载量值有很好的相关性。     

转染反义磷脂酶A2寡核苷酸抑制LPS诱导Hela细胞分泌IL-1β和IL-6

目的：研究脑浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2,85—kD PLA2)在脂多糖诱导Hela细胞释放细胞因子IL-1β、IL-6的信号机制中的作用。方法：①利用脂质体将cPLA2的反义寡核苷酸转染入Hela细胞，通过聚合酶链式反应(RT—PCR)及Western杂交印迹分析检验胞浆中cPLA2人水平的变化；②用放免方法检测不同时间培养上清中的IL-1β、IL-6浓度。结果：①转染后cPLA2的蛋白表达明显减少，但mRNA水平未见显著改变；②Hela细胞释放IL-1β、IL-6随cPLA2人反义寡核苷酸浓度的增加而减少。结论：cPLA2人LPS刺激的Hela细胞释放炎性细胞因子IL-1β、IL-6的过程中可能发挥重要的信号传递作用。     

NR2B反义寡核苷酸对脑缺血海马CA1区NR2BmRNA表达的影响

为研究NMDA受体2B亚单位(NR2B)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide to NR2B,ANR2B)对短暂性脑缺血后海马CA1区NR2B mRNA表达的影响,分别向成年SD大鼠海马CA1区内立体定位注射ANR2B、NR2B正义寡核苷酸(SNR2B)、无菌生理盐水(NS),或者插针不注射(NSNO),24h后行四动脉阻断前脑缺血手术(缺血15min、再灌注24h),经心冲灌固定取脑,连续冰冻切片,原位杂交组织化学方法染色,光镜下观察各组每侧鼠脑NR2B mRNA的表达变化,并用LEICAQWin进行图像分析。结果显示,单纯缺血组海马各区的NR2B mRNA显色强度明显增加;缺血再灌组、假手术组和正常组海马CA1区内ANR2B注射点及其周围的NR2B mRNA显色明显下降;而在注射SNR2B、NS或NSNO的各组海马切片上,NR2B mRNA显色均无明显变化。结果表明ANR2B可以特异性地在体局部防止缺血后NR2B mRNA的高水平表达。     

DNA免疫诱导小鼠产生抗人心肌肌钙蛋白T抗血清的研究

目的 通过基因免疫诱导BALB／c小鼠产生抗人心肌肌钙蛋白T(cTnT)的抗体应答，并比较不同免疫佐剂、预处理方法对免疫应答的影响。方法 构建cTnT的真核表达质粒pCI-cTnT，大量提取、PEG纯化质粒，通过肌肉注射免疫BALB／c小鼠并加强免疫，每隔2周取血，ELISA法分析抗cTnT的体液应答，免疫印迹检测抗血清的特异性。并比较布吡卡因预处理、CpG ODN核酸佐剂、弗氏不完全佐剂对抗体应答效果的影响。结果 接种pCI-cTnT质粒的小鼠血清中检测出抗cTnT特异性抗体，加强免疫使抗体滴度提高；使用CpGODN后免疫应答增强，弗氏不完全佐剂可明显增强免疫效果，而吡卡因预处理使应答水平下降；初次免疫后14周仍可测得较高的抗体应答。结论 采用含cTnT基因的质粒DNA免疫，成功地诱导小鼠产生抗cTnT的抗体；传统的弗氏不完全佐剂可作为核酸免疫的佐剂使用。     

bcl—2基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响

目的：探讨ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响。方法：应用细胞培养，免疫标记及流式细胞仪技术，检测了ｂｃ１－２基因反义寡脱氧核糖核苷酸（ＡＳＯＤＮ）和阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）对白血病Ｋ５６２和ＨＬ－６０细胞作用和ｂｃｌ－２基因表达。结果：Ａｒａ－Ｃ（１０μｍｏｌ／Ｌ）与ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ同时作用比单独用Ａｒａ－Ｃ或Ａｒａ－Ｃ与正义寡脱氧核糖核苷酸（ＳＯＤＮ）细胞存活率显著减少（Ｐ＜０００１），并且流式细胞仪检测显示ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ使ｂｃｌ－２蛋白阳性率降低。结论：ｂｃｌ－２基因反义寡核苷酸能抑制该基因表达，提高白血病细胞对Ａｒａ－Ｃ的敏感性     

反义Gαq/11亚基ODNs对平滑肌细胞DNA合成和PC蛋白表达的影响

目的：探讨Ｇｑ蛋白介导血管活性多肽对ｖＳＭＣＤＮＡ合成及增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）蛋白表达的影响。方法：用硫代修饰的Ｇαｑ／１１亚基反义寡聚脱氧核苷酸（Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ），以６μｍｏｌ／Ｌ的浓度加入含１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１ＥＴ－１刺激无血清ＤＭＥＭ培养基中体外培养ｖＳＭＣ。用３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定ｖＳＭＣＤＮＡ合成、免疫细胞化学技术检测ｖＳＭＣＰＣＮＡ蛋白表达。结果：Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ可明显抑制ｖＳＭＣＤＮＡ的合成，在１２ｈ，２４ｈ时抑制率分别为８４２％和８５３％；Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ亦明显降低ｖＳＭＣＰＣＮＡ蛋白的表达。而相同浓度的正义Ｇαｑ／１１ＯＤＮｓ只呈现少量抑制作用。结论：本实验提示Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ有可能进一步应用于由血管活性多肽刺激引起的ｖＳＭＣ增生性疾病如经皮冠脉腔内血管成形术（ＰＴＣＡ）后再狭窄的防治的研究     

用逆转录PCR-核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒分型诊断

目的 建立一种逆转录PCR-核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒(CVB1～6)进行分型诊断。方法 一对通用PCR引物，它能有效扩增所有CVB1-6型的特异性DNA片段；另选取6条各型特异性寡核苷酸探针，将它们分别共价结合在不同的微孔板上。经过一次PCR扩增，扩增后的产物分别与包被有不同探针的微孔板进行杂交检测，从而有效鉴别CVB各型。结果 本法与ELISA法的分型比较显示它们具有很好的一致性，无错误分型。对152例IgM抗体阳性标本的检测，该方法阳性率为71．7％。结论 本法可准确对CVB进行分型，为CVB的临床诊断及流行病学调查提供了一种有效的方法。     

Survivin反义核酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的一个成员，具有强大的抗细胞凋亡功能，在几乎所有肿瘤组织中特异性表达，而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达。本研究针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核甘酸，RT—PCR检测表明，该序列反义寡核苷酸可明显降低细胞中survivin基因的mRNA含量；Western印迹显示Survivin蛋白水平也被降低。MTT比色实验法检测结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制SMMC-7721细胞增殖，抑制率为43％，远高于无义寡核苷酸组和空白对照组。反义寡核苷酸还显著增强SMMC-7721细胞对于抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性，TUNEL法检测结果显示，在较低高三尖杉酯碱浓度下，反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组。本研究结果提示，survivin表达的靶向抑制有望应用于肿瘤的辅助治疗之中。     

表达载体介导的反义RNA抑制人巨噬细胞移动抑制因子的表达

目的：研究表达载体介导的反义RNA对人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的抑制作用。 方法:用亚克隆技术构建可转录MIF反义RNA的真核表达载体pcDNA3-antiMIF。用lipofectamine2000分别将pcDNA3、pcDNA3-antiMIF转染可表达MIF的HEK293(293-MIF)细胞，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA表达水平。将pcDNA3-antiMIF转化人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，建立可表达MIF反义RNA的HUVECs(HUVECs-antiMIF)细胞。将MIF的真核表达载体pSecTag-MIF转染HUVECs-antiMIF，用Real-time定量PCR鉴定MIF mRNA的表达水平。 结果:正确构建了MIF反义RNA的表达载体pcDNA3-antiMIF。MIF 反义RNA对293-MIF细胞中MIF表达的抑制水平达32%（P<0.05）。建立稳定表达MIF反义RNA的HUVECs-antiMIF细胞株。HUVECs-antiMIF中MIF的表达受到抑制，表达水平降低40%（P<0.05）。 结论:表达载体介导的反义RNA能有效地抑制MIF的表达，建立了稳定表达MIF反义RNA的HUVECs。     

转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长和化疗敏感性的影响

目的 研究转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长的影响以及转染后淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性。方法 构建survivin反义mRNA真核表达质粒pcDNA3．1-反义（As）survivin;利用脂质体转染法将其转入高表达survivin mRNA T淋巴母细胞淋巴瘤Jurkat细胞系,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫组织化学SP法、Western印迹法检测细胞中survivin表达;用细胞计数、流式细胞术（FCM）检测其细胞生长曲线、细胞凋亡指数,并进行光镜、电镜形态学观察;并对转染pcDNA3．1-Assurvivin前后Jurkat细胞分别加入4-羟基-环磷酰胺（CTX）、甲氨蝶呤（MTX）72h后,常规MTT检测细胞存活率。结果 RT—PCR检测转染pcDNA3．1-Assurvivin后48h、5和6周Jurkat细胞survivin mRNA表达,发现survivin mRNA表达皆低于对照组;转染后survivin蛋白表达也明显降低。转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞生长倍增时间（52h）明显延长;用FCM检测细胞凋亡发现,转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞凋亡指数[20．2％（48h）]明显高于对照组（转染空质粒和未转染组,2．1％和1．3％）;5和6周为6．2％和6．8％,明显高于未转染细胞（1．3％和1．0％）。光镜、电镜观察见转染细胞出现较多凋亡细胞及一些变性肿胀细胞;MTT检测结果显示Jurkat细胞转染前后,经化疗药物4-羟基-环磷酰胺和甲氨蝶呤作用,转染细胞的抑制率明显大于未转染组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 survivin基因对Jurkat细胞系的生长起着重要的作用,抑制survivin基因表达在T淋巴母细胞淋巴瘤治疗中可能有重要的意义,该基因似可能作为治疗的靶点。