竹荪多糖对亚砷酸钠致人肝细胞毒性的拮抗作用

目的探讨竹荪多糖对亚砷酸钠致人胎肝(L-02)细胞毒性的拮抗作用。方法将处于对数生长期的L-02细胞分别暴露于含不同浓度[0(对照)~80μmol/L]亚砷酸钠和[0(对照)~160μg/ml]竹荪多糖+10μmol/L亚砷酸钠的培养液中暴露24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞存活率。将处于对数生长期的L-02细胞分设对照(培养基)组、亚砷酸钠(10μmol/L)组、竹荪多糖(80μg/ml)组和联合处理(10μmol/L亚砷酸钠+80μg/ml竹荪多糖)组,暴露24 h后,检测细胞培养液中丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原性谷胱甘肽(GSH)、细胞色素C(Cyt-C)水平和天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的活力及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X(Bax)蛋白的表达水平。结果与对照组比较,除2.5和5μmol/L亚砷酸钠染毒组外,10~80μmol/L亚砷酸钠染毒组L-02细胞的存活率均下降,差异有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,L-02细胞的存活率呈下降趋势。与对照组比较,40、80和160μg/ml竹荪多糖联合处理组L-02细胞的存活率均升高,差异有统计学意义(P0.05);其中,以80μg/ml竹荪多糖的拮抗效果最好。与对照组比较,亚砷酸钠组和联合处理组L-02细胞培养液中MDA和Cyt-C的水平升高,T-SOD、CAT及GSH的水平降低,差异均有统计学意义(P0.05);而竹荪多糖组L-02细胞培养液中上述指标均无明显变化。与亚砷酸钠组比较,联合处理组和竹荪多糖组L-02细胞培养液中MDA和Cyt-C的水平降低,T-SOD、CAT及GSH的水平升高,差异均有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,亚砷酸钠组和联合处理组L-02细胞胞内Caspase-3的活力升高,差异具有统计学意义(P0.05);而竹荪多糖组L-02细胞细胞内Caspase-3的活力无明显变化。与亚砷酸钠组比较,联合处理组和竹荪多糖组L-02细胞内Caspase-3的活力均降低,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,亚砷酸钠组和联合处理组L-02细胞胞内Bcl-2、Bax蛋白的表达水平升高,Bcl-2/Bax比值降低,差异均有统计学意义(P0.05);而竹荪多糖组L-02细胞上述指标均无明显变化。与亚砷酸钠组比较,联合处理组和竹荪多糖组L-02细胞胞内Bax蛋白的表达水平降低,Bcl-2/Bax比值升高;竹荪多糖组L-02细胞内Bcl-2蛋白的表达水平降低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论亚砷酸钠可以诱导L-02细胞氧化应激,通过激活线粒体途径的细胞凋亡发挥毒性作用;竹荪多糖可以通过抑制上述机制,拮抗亚砷酸钠所致L-02细胞的毒性作用。     

亚砷酸钠对HaCat细胞活力及磷酸化蛋白激酶B表达的影响

为探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对人角质形成细胞(HaCat)活力及蛋白激酶B(PKB/Akt)磷酸化活化的影响,本研究以Alamar Blue还原法检测NaAsO2(0,5,10,25,50,100μmol/L)作用于HaCat细胞6 h后细胞的活力水平;并以Western blot法检测NaAsO2(0,25,50μmol/L)作用于HaCat细胞6 h后细胞中磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的蛋白表达情况。结果表明,NaAsO2作用6 h,Alamar Blue还原率随NaAsO2染毒剂量的升高而显著下降,具有显著的剂量-效应关系;NaAsO2染毒组细胞内p-Akt表达水平与对照组相比均显著提高,提示砷性肿瘤的发生可能与p-Akt蛋白表达水平增高有关。     

亚砷酸钠诱导的活性氧增加人皮肤细胞N6 -甲基腺苷水平

目的 探究亚砷酸钠诱导的活性氧是否影响N6 -甲基腺苷（m6A）水平,从RNA表观遗传学角度探讨亚砷酸钠的毒性机制。方法 以亚砷酸钠作为活性氧诱导剂,以N -乙酰半胱氨酸作为活性氧清除剂,检测细胞在亚砷酸钠单独处理和亚砷酸钠联合N -乙酰半胱氨酸处理情况下皮肤细胞活性氧积累情况,同时测定m6A及其甲基化酶的mRNA和蛋白水平的改变。结果 在5、10和15 μM的亚砷酸钠处理下,活性氧含量随砷浓度升高而增加;在亚砷酸钠染毒浓度为15 μM时,细胞内总m6A水平水平相比于对照组升高了1.49倍（P＜0.05）,m6A甲基化酶（METTL3、METTL14和WTAP）mRNA表达水平相应升高（P＜0.05）,METTL14和WTAP蛋白表达水平分别为对照组的1.47倍和1.85倍（P＜0.05）。N -乙酰半胱氨酸可以降低异常升高的活性氧、m6A以及其甲基化酶水平。结论 亚砷酸钠诱导的活性氧能增加人皮肤细胞m6A的修饰水平,其机制可能与上调m6A甲基化酶表达水平有关。     

砷诱导L-02细胞的耐砷性及细胞内MDR1、GST-π基因的表达

[目的]观察砷诱导人胚肝（L-02）细胞耐砷性及细胞内耐砷性多药耐药基因1（MDR1）、谷胱甘肽-s-转移酶7【（GST-π）的表达水平。[方法]应用噻唑蓝（MTY）比色法检测浓度分别为0、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol／L的亚砷酸钠（NaAs02）作用24h后,对L-02细胞生存率的影响。并选择细胞生存率在90％～95％时的NaAsO2浓度为诱导浓度对细胞进行培养,以不加砷诱导的L-02细胞为对照,两组细胞在相同条件下培养6周,利用MTY法每周观察细胞生存率并计算半致死浓度（LC50）来反映细胞对砷的耐受性改变;利用real-timePCR检测培养6周后的细胞内MDRl、GST．叮rmRNA的表达情况;免疫组化法（SABC法）检测细胞内P-糖蛋白（P-gp）、GST-x蛋白的表达情况。利用MTr法和石墨炉原子吸收光谱法检测浓度为10mmol／L的NaAsOz作用24h后细胞生存率和细胞内总砷浓度以观察两组细胞在再次大剂量急性砷中毒中的反应。[结果]经NaAsO：诱导6周后,诱导细胞LC50和生存率都明显高于正常细胞（P〈0．001）;诱导细胞MDR1、GST-1TmRNA的表达明显较正常细胞高（P〈0．001）;与对照组比较,诱导细胞P-gp、GST-π蛋白表达明显增高（P〈0．001）;在再次急性砷中毒试验中,诱导细胞生存率明显高于正常细胞（P〈0．001）,诱导细胞内总砷浓度较正常细胞低（P〈0．001）。[结论]L-02细胞具有可诱导的对砷的耐受现象,其耐砷性可能与MDR1、GST-π基因高表达有关。     

急性砷暴露对小鼠脾脏核转录因子NF-E2相关因子2信号通路的影响

目的探讨急性砷暴露小鼠脾脏核转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)及其下游血红素单加氧酶-1(HO-1)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白的表达。方法将48只健康8周龄清洁级昆明雌性小鼠按体重随机分为4组,分别为对照(生理盐水)组和5、10、20 mg/kg亚砷酸钠染毒组,每组12只。给予小鼠一次性灌胃亚砷酸钠24 h后,测定脾组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力以及Nrf2、HO-1和GST蛋白的表达水平。结果与对照组相比,各剂量亚砷酸钠染毒组小鼠脾组织中MDA含量均增加,差异有统计学意义(P0.05);20 mg/kg亚砷酸钠染毒组小鼠脾组织中SOD活力和10、20 mg/kg亚砷酸钠染毒组小鼠脾组织中GSH-Px活力均减少,差异有统计学意义(P0.05)。且随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,小鼠脾组织中SOD和GSH-Px活力均呈下降趋势,而MDA含量呈上升趋势。与对照组相比,各剂量亚砷酸钠染毒组小鼠脾组织中HO-1和GSTO1/2蛋白的表达水平及10、20 mg/kg亚砷酸钠染毒组小鼠脾组织中Nrf2蛋白的表达水平均增加,差异有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,小鼠脾组织中Nrf2、HO-1和GSTO1/2蛋白的表达水平均呈上升趋势。结论急性砷暴露在导致小鼠脾脏发生氧化损伤的同时,能够活化Nrf2信号通路,诱导下游抗氧化相关酶类蛋白表达,这可能是砷暴露刺激机体产生的一种防御应答反应。     

组蛋白修饰改变在亚砷酸钠毒性效应中的作用研究

目的： 探讨组蛋白H3修饰在亚砷酸钠暴露引起的毒性效应中的作用及其调控机制。方法：在HBE细胞中构建组蛋白H3赖氨酸修饰位点突变的细胞株,用亚砷酸钠作用于细胞,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测其细胞毒性;用微核实验检测组蛋白H3K4突变后对亚砷酸钠诱导DNA损伤的影响;用蛋白印迹检测亚砷酸钠对H3K4甲基化蛋白表达的影响并用qRT-PCR筛查了其上游修饰酶mRNA水平的表达。结果：组蛋白修饰缺陷细胞株中,H3K4修饰缺陷后的HBE细胞在1 μmol/L亚砷酸钠染毒作用下细胞活力降低60%左右(P<0.01),且可致HBE细胞双核微核率升高2倍以上(P<0.01);1 μmol/L亚砷酸钠处理HBE细胞可引起H3K4me2/3 蛋白水平升高(P<0.05),同时赖氨酸特异性去甲基化修饰酶1(LSD1)的表达下降(P<0.01)。结论：亚砷酸钠染毒诱导细胞组蛋白修饰发生改变,其中H3K4甲基化修饰水平上调,可能参与砷引发的细胞毒性和遗传毒性过程,其修饰改变可能受到LSD1 的调控。     

JNK信号通路对NaAsO2诱导NIH3T3细胞中hnRNP K蛋白聚集体形成的影响

 目的：观察核不均一核糖核蛋白(hnRNP)K的表达与定位以及亚砷酸钠（NaAsO2）刺激NIH3T3细胞的反应情况及氧化应激变化,探讨JNK信号通路在hnRNP K蛋白聚集体形成中的作用。方法：构建重组载体pcDNA3-hnRNP K-HA,转染NIH3T3细胞,荧光显微镜观察内源性hnRNP K在细胞中的表达与定位,以及在NaAsO2不同刺激时间该蛋白聚集体的形成情况,并利用活性氧（ROS）检测试剂盒测定胞内ROS水平;给予JNK、MEK、PI3K/Akt、NF-κB和核转运等5种信号通路的抑制剂预处理后,观察聚集体的变化情况。结果：重组质粒构建正确,荧光显微镜观察显示hnRNP K主要定位于胞核中,而重组质粒转染NIH3T3细胞后,可见胞内有蛋白聚集体形成并随NaAsO2刺激时间的延长而递增,且过表达hnRNP K可抑制NaAsO2刺激细胞生成ROS;JNK信号通路抑制剂SP600125明显抑制聚集体的形成。结论：hnRNP K主要定位在NIH3T3细胞的胞核中,胞浆少量分布;NaAsO2可诱导NIH3T3细胞形成hnRNP K蛋白聚集体,此聚集体可抑制胞内ROS生成,且该聚集体的形成有赖于JNK介导的信号通路。     

砷对小鼠心脏某些生化功能的影响

通过体外心肌细胞培养试验和动物实验，探讨了砷对心脏某些生化功能的影响。体外试验表明，砷处理４小时后，细胞悬液中谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量，谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性明显降低，丙二醛（ＭＤＡ）水平则显著增高。整体实验表明，砷染毒２４小时后，心肌匀浆中ＧＳＨ含量低剂量组显著增加，高剂量组显著下降；中、高剂量组ＳＯＤ活性显著降低；低、中、高剂量组ＧＳＨ－Ｐｘ活性显著降低；中、高剂量组ＭＤＡ水平则显著增高。提示砷可对心脏某些生化功能有影响，推测可能与砷诱发的对心肌氧化性损伤有关     

亚砷酸钠对果蝇的伴性隐性致死试验研究

我们研究了亚砷酸钠(NaAsO_2)对果蝇生殖细胞的遗传损伤作用。应用野生型Oregonk品系雄蝇(灰身圆红眼)与Base品系雌蝇(灰身棒杏眼)进行交配,按文献报道的方法进行伴性隐性致死试验,结果如下。 一、NaAsO_2对OregonK雄蝇的致死毒性     

3种抗氧化剂对亚砷酸钠染毒人膀胱上皮细胞血管内皮生长因子表达的拮抗作用研究

目的探讨抗氧化剂褪黑素(melatonin,MEL)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)、维生素C(Vitamin,VC)对砷诱导人正常膀胱上皮(SV-HUC-1)细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的拮抗作用。方法将处于对数生长期的SV-HUC-1细胞暴露于含终浓度分别为0(对照)、0.5、1、2、4、8、10μmol/L亚砷酸钠的F12K完全培养基染毒24 h,或者含终浓度分别为4、10μmol/L亚砷酸钠的F12K完全培养基染毒0(对照)、4、12、24、48、72 h;联合暴露组在加入含终浓度分为4μmol/L亚砷酸钠的F12K完全培养基前30 min分别加入1%二甲基亚砜(DMSO)和抗氧化剂MEL、VC、NAC(终浓度分别为0.5、1、1 mmol/L),染毒24 h。分别采用Western blot法和RT-PCR法检测SV-HUC-1细胞VEGF蛋白和mRNA的表达水平。结果 10μmol/L亚砷酸钠染毒组SV-HUC-1细胞VEGF mRNA的表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,SV-HUC-1细胞VEGF mRNA的表达水平呈上升趋势。与对照组比较,4μmol/L亚砷酸钠染毒12、24、48 h及10μmol/L亚砷酸钠染毒24和48 h后SV-HUC-1细胞VEGF mRNA的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠染毒时间的延长,各剂量组SV-HUC-1细胞VEGF mRNA的表达水平均呈先上升后下降的趋势。与对照组比较,4μmol/L亚砷酸钠+DMSO染毒组SV-HUC-1细胞中VEGF蛋白的表达水平均增加,差异有统计学意义(P0.05)。与4μmol/L亚砷酸钠+DMSO染毒组比较,亚砷酸钠+NAC染毒组SV-HUC-1细胞中VEGF蛋白的表达水平较高,差异有统计学意义(P0.05);而亚砷酸钠与MEL和VC联合染毒组SV-HUC-1细胞中VEGF蛋白的表达水平无明显改变。结论砷能诱导人正常膀胱上皮细胞VEGF表达增加,NAC能增加VEGF表达。