EPHX2基因过表达质粒的构建及意义探讨

目的：构建LETO、OLETF大鼠EPHX2基因过表达重组质粒,观察其在人胚肾细胞（human embryonic kidney 293T,HEK293T）中的表达,及对HEK293T细胞NF-κBp65 mRNA表达的影响.方法：提取LETO、OLETF大鼠肾脏组织总RNA,RT-PCR方法扩增编码EPHX2基因的cDNA,克隆至T-载体并测序,经亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建两型大鼠EPHX2过表达重组质粒,酶切鉴定并测序,采用磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞系.Western Blot方法检测EPHX2融合蛋白的表达,RT-PCR方法检测EPHX2基因过表达对HEK293T细胞NF-κBp65表达水平的影响.结果：（1）两个重组质粒均含有完整EPHX2 cDNA,测序证实OLETF型大鼠较LETO型大鼠EPHX2重组质粒有五个核苷酸位点的改变.（2）转染HEK293T细胞后,Western Blot证实融合蛋白成功表达;（3）TNF-α刺激增加HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达;（4）EPHX2基因过表达促进TNF-α刺激后的HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达升高（P〈0.05）.结论：成功构建LETO型及OLETF型大鼠EPHX2过表达重组质粒（L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5）,可在HEK293T细胞中过表达.为进一步探讨EPHX2基因在糖尿病肾病发生发展中的作用奠定了基础.     

人IL-12基因与糖基化磷脂酰肌醇信号肽序列融合基因真核双表达质粒的构建及表达

目的将糖基化磷脂酰肌醇（GPI）信号肽序列与人白细胞介素12（hIL-12）基因拼接成融合基因,构建该融合基因的真核双表达质粒,并检测融合基因在肾癌细胞的表达。方法将人胎盘碱性磷酸酶-1（hPLAP-1）C末端信号肽序列与hIL-12的P40亚基基因进行拼接,亚克隆至真核双表达质粒pBudCE4．1,再将IL-12的P35亚基基因亚克隆至pBudCE4.1的另一个多克隆位点。酶切及测序鉴定质粒。将质粒转染肾癌细胞株RC-2,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测其表达。结果分别成功扩增出IL-12 P40基因987bp和P35基因762bp,合成hPLAP-1C末端信号肽序列117bp,并将GPI信号肽序列与P40基因成功拼接,成功构建了真核表达载体pBudCE4．1／IL-12A／IL-12B-GPI（命名为pBIG）,经酶切及测序鉴定正确。激光共聚焦显微镜观察带锚定蛋白的IL-12在肾癌细胞膜上高表达,并能被磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C洗脱。结论真核双表达载体pBIG的构建及表达,为进一步制备肾癌疫苗奠定了基础。     

慢病毒在大鼠胶质瘤细胞基因转导中的应用

目的应用慢病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。方法构建慢病毒表达质粒pLenti6/V5-TK并以PCR、酶切及测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统,将重组质粒与包装混合物（Packaging Mix）共同转染293T细胞生产假病毒颗粒,转染48 h后收集培养上清,用其感染大鼠9L胶质瘤细胞,以抗稻瘟菌素（BSD）筛选出9L-TK细胞。RT-PCR、Western blot方法检测TK基因在9L-TK细胞中的表达。用MTT方法测试更昔洛韦（GCV）对体外培养的9L-TK细胞杀伤效果。结果构建的重组质粒pLenti6/V5-TK经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7×10^5转导单位（TU）/ml。经BDS筛选获得的9L-TK细胞RT-PCR及Western blot结果显示TK基因表达阳性,且GCV对该细胞作用敏感。结论成功利用慢病毒实现了TK基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

内毒素结合肽表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

应用PCR技术,从含人NH@LBP cDNA的质粒中扩增出93bp的内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)基因片段,插入原核融合蛋白表达质粒Pinpoint Xa3的多克隆位点构建成表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组子Pinpoint Xa3-EBP并进行酶切鉴定及序列分析.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,经SDS-PAGE及Westen blot鉴定得到分子量约为16.5kD的生物素化EBP融合蛋白,为进一步研究其内毒素拮抗效应打下良好基础,并为内毒素结合肽的研究提供了一条新的途径.     

质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性

目的：探讨应用阳离子脂质体lipofectamine2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性．方法：构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达质粒．将22只雄性SD大鼠随机分为4组：阴性对照组（Ⅰ组，n=4），心肌注射组（Ⅱ组，n=6），尾静脉注射组（Ⅲ组，n=6）和冠状动脉灌注组（Ⅳ组，n=6）．分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染．Ⅱ～Ⅳ组于转染后2，14d时间点各随机处死3只大鼠，阴性对照组各处死2只大鼠，取心肌组织作快速冰冻切片，荧光显微镜下观察EGFP表达情况．结果：在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，阴性对照组隐约可见淡绿色荧光，第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织．各转染组荧光强度与阴性对照组相比，其差异均有统计学意义（P〈0．05）．心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义（P=0．17）．冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7．37倍（P=0．013）．第2周转染各组荧光强度明显减弱，与阴性对照组差异无统计学意义（P=0．41）．结论：阳离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织，而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率．     

Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒的构建和制备

目的:以pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒。方法:采用RT-PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165cDNA片段,分别插入pUCm-T载体构成pUC-VEGFs;限制性内切酶SalⅠ、KpnⅠ切下目的基因片段,插入pAdTrack-CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack-CMV-VEGFs。电转法将被PmeⅠ切成线性的pAdTrack-CMV-VEGFs转入E coli BJ5183,与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy-VEGFs。阳离子脂质体法将被PacⅠ线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装。转染后7～11d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(GFP)呈彗星状,收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液。感染293T细胞3～4次,待细胞出现细胞病变效应(CPE)时收获腺病毒(Ad-VEGFs),并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化。结果:重组腺病毒在电镜下呈多面体,形态完整;Ad-VEGF121和Ad-VEGF165病毒滴度分别达到1.155×1012和1.281 5×1012 V.P/mL。结论:利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便,易掌握。获得的重组腺病毒纯度高、滴度高,适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗。     

A mutant of Saccharomyces cerevisiae with impaired maintenance of centromeric plasmids

Summary A mutant with unstable maintenance of hybrid plasmids containing either one of the centromeric loci CEN3, CEN6, CEN11 and arsl or the replicator of the 2 plasmid has been obtained. The frequency of loss of hybrid plasmids in the mutant was up to 3 · 10^–1 per one generation versus 10^–2 in the original strain. The unstable maintenance of minichromosomes in the mutant is controlled by a recessive nuclear gene, named SMC for stability of minichromosomes. Loss of some minichromosomes is connected with impairment of their segregation in cell division. In diploids homozygous for smc mitotic chromosomal segregation is not affected but sporulation is impaired. The question of adequacy of usage of minichromosomes for selection of mutants with impaired function of centromeric loci is discussed.     

质粒提取及酶切图谱鉴定

本实验是采取碱变性方法从重组大肠杆菌中提取质粒DNA,并用EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ两种限制性内切酶对质粒DNA进行适当酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳对DNA酶切图谱加以鉴定。通过在紫外灯下观察电泳结果,证实利用碱变性方法提取质枉,同时通过酚氟仿抽提,得到的质粒DNA纯度比较高。并且证实酶切图谱与预计相符。从而说明在一般工厂的实验务件下可以进行操作。