特应性皮炎患者外周血调节性T细胞及皮损中miR-31、Foxp3的表达

目的 探讨特应性皮炎（AD） 患者外周血调节性T细胞（Treg 细胞）及皮损组织中miR-31、Foxp3的表达水平及其相关性。方法 用流式细胞仪检测37例AD患者外周血Treg细胞的比例,实时荧光定量RT-PCR检测miR-31及Treg细胞特异性转录因子Foxp3 mRNA的表达水平;并以33例性别、年龄匹配的健康儿童做对照。检测5例急性期AD患者皮损与皮损周围组织中miR-31及Foxp3 mRNA的表达水平,并以5例健康人皮肤组织标本为对照。采用独立样本t检验、单因素方差分析和线性相关进行统计学分析。结果 AD患者外周血Treg细胞比例明显低于健康对照组（2.12% ± 0.60%比4.99% ± 1.27%,P < 0.01）;miR-31 mRNA表达水平明显高于健康对照组（6.01 ± 1.76比1.62 ± 0.51,P < 0.01）;Foxp3 mRNA表达水平显著低于健康对照组（0.78 ± 0.17比1.87 ± 0.71,P < 0.01）。AD患者皮损、皮损周围组织及健康人皮肤组织中miR-31及Foxp3 mRNA表达水平间差异均有统计学意义。miR-31表达水平：皮损 > 皮损周围组织 > 健康人皮肤组织,F = 54.501,P < 0.01;Foxp3表达水平：皮损 < 皮损周围组织 < 健康人皮肤组织,F = 37.837,P < 0.01。AD患者外周血miR-31 mRNA表达水平与疾病严重程度评分呈正相关（r = 0.417,P = 0.010）,与Treg细胞比例（r = -0.404,P = 0.013）及Foxp3 mRNA表达水平呈负相关（r = -0.409,P = 0.012）;皮损及皮损周围组织中miR-31 mRNA表达水平与Foxp3 mRNA表达水平呈负相关（r = -0.392,P = 0.032）。结论 AD患者miR-31高表达及Foxp3低表达可能与AD的发病相关。 【关键词】 皮炎,特应性; miR-31; T淋巴细胞,调节性; Foxp3     

miR-203a-3p通过ALOX15途径抑制胃癌细胞铁死亡

目的探讨miR-299-3p靶向调控OCT4B1对结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用。 方法将SW480细胞分为NC组、mimics组、inhibitor组,采用MTT法检测细胞活力,结晶紫染色检测单克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭能力,qRT-PCR测定细胞miR-299-3p和OCT4B1 mRNA,蛋白免疫印迹法测定OCT4B1蛋白表达。荧光素酶报告基因检测miR-556-3p对SW480细胞OCT4B1活性的调控作用。 结果与NC组比较,miR-299-3p水平、细胞凋亡率mimics组升高,inhibitor组降低,且mimics组高于inhibitor组(P＜0.05);OCT4B1 mRNA和蛋白水平、细胞穿膜数、细胞存活率、单克隆形成数mimics组降低,inhibitor组升高,且mimics组低于inhibitor组(P＜0.05)。 结论miR-299-3p过表达可抑制结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡,可能与miR-299-3p抑制OCT4B1 mRNA和蛋白表达有关。     

miR-885-3p靶向AKT1对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响

目的 探究miR-885-3p对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响以及作用机制。方法 荧光定量PCR检测经不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)X射线照射后HT-29细胞中miR-885-3p的表达量;建立过表达miR-885-3p细胞株,功能试验探讨其对HT-29细胞放射敏感性的影响;生物信息学预测miR-885-3p下游调控的靶基因,双荧光素酶报告基因法进一步验证;上调和下调miR-885-3p表达量探讨miR-885-3p与靶基因丝苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)表达量的调控关系;慢病毒转染敲减AKT1表达量,观察其对HT-29细胞放射敏感性的影响;共转染miR-885-3p模拟物,探讨过表达AKT1对miR-885-3p诱导的HT-29细胞放射敏感性的影响。结果 miR-885-3p在放射诱导的HT-29细胞中表达上调(F=46.64,P<0.05);过表达miR-885-3p和敲减AKT1可通过抑制HT-29细胞存活、促进其凋亡,从而增强HT-29细胞放射敏感性(t=12.33、12.95,P<0.05),放射增敏比(SER)分别为1.602和1.946;抑制miR-885-3p可通过促进HT-29细胞存活、抑制其凋亡从而促进HT-29细胞放射抵抗(t=11.94,P<0.05),SER为0.839;AKT1是miR-885-3p下游靶基因;过表达AKT1反转miR-885-3p增强HT-29放射敏感性的作用,SER为0.680。结论 miR-885-3p通过直接靶向AKT1增加结直肠癌HT-29细胞放射敏感性,为提高临床结直肠癌放疗敏感性提供一个靶点。     

miR-875-5p通过靶向USF2抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨miR-875-5p对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法:采用qPCR法检测胃癌细胞BGC-823、HGC-27、MGC-803、SGC-7901、AGS、MKN-45和胃黏膜上皮细胞GES-1中miR-875-5p的表达水平。利用脂质体转染技术,分别将miR-875-5p模拟物/抑制剂(mimic/inhibitor)及其阴性对照质粒(miR-NC/Anti-miR-NC)转染至AGS细胞/MKN-45细胞,构建过表达/抑制miR-875-5p的细胞模型,空白对照组(Control组)不转染。通过CCK-8、克隆形成、Transwell等实验分别检测miR-875-5p表达变化对细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-875-5p与上游刺激因子2(USF2)的靶向关系,WB实验验证miR-875-5p对USF2的调控作用并检测USF2蛋白的表达。构建MKN-45细胞裸鼠移植瘤模型,验证miR-875-5p过表达对MKN-45细胞成瘤能力的影响。结果:miR-875-5p在6种胃癌细胞中表达水平显著低于胃黏膜上皮细胞GES-1(均P<0.01)。与Control组和miR-NC组相比,miR-875-5p mimic组AGS细胞的增殖、克隆形成率、迁移和侵袭细胞数,以及USF2蛋白的表达均显著降低(P<0.05或P<0.01);miR-875-5p inhibitor组MKN-45细胞的增殖、克隆形成率、迁移和侵袭细胞数,以及USF2蛋白的表达均显著提高(P<0.05或P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证明,miR-875-5p能够直接靶向USF2基因。体内成瘤实验结果表明,过表达miR-875-5p显著抑制MKN-45细胞移植瘤的生长(均P<0.01)。结论:miR-875-5p通过靶向USF2抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

miR-134靶向EGFR对非小细胞肺癌增殖的影响

目的 探讨微小RNA-134（miR-134）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测miR 134在NSCLC细胞株（A549、H252）和正常胚肺细胞株WI38中的表达情况;将A549和H252细胞分为3组,分别为空白对照组（不转染）、miR-NC组（转染不相关siRNA）和miR-134组（转染miR-134 mimics）。分别于转染后24、48、72、96h收集细胞,采用MTS法检测细胞的增殖情况;转染后96h用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;双荧光素酶报告基因实验检测miR-134与表皮生长因子受体（EGFR）3’UTR的结合情况,QPCR检测过表达miR-134的A549和H252细胞中EGFR的表达情况。结果 与WI38 细胞相比,miR-134在A549细胞中的表达下调85.91％,在H252细胞中下调78.13％（P＜0.05）。MTS检测显示,miR-134能显著降低A549和H252细胞的增殖能力,并呈时间依赖性。流式细胞仪检测显示,与空白对照组比较,miR-134组A549细胞的凋亡比例提高226.31％,H252细胞提高47.85％（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示miR 134能与EGFR3’UTR结合,显著降低荧光值（P＜0.05）。QPCR检测显示,与空白对照组比较,转染miR-134 mimics 后,EGFR在A549细胞中的相对表达量下调57.0％,在H252中下调35.0％,差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 miR-134在NSCLC中低表达,能通过靶向EGFR抑制NSCLC细胞增殖,并诱导凋亡。     

微小RNA-181b-5p对皮肤黑素瘤细胞株增殖和侵袭的作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨微小RNA（miRNA）-181b-5p是否通过靶向普列克底物蛋白（PLEK）抑制皮肤黑素瘤（CM）细胞的增殖及侵袭能力。方法 生物信息学分析CM核心基因;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181b-5p和PLEK的靶向结合。采用RNA oligo和siRNA分别调控A375细胞miRNA-181b-5p和PLEK的表达,具体分组为：模拟物阴性对照组、miRNA-181b-5p模拟物组、抑制剂阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂组、PLEK siRNA组、siRNA阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂和对照siRNA共转染组以及miRNA-181b-5p抑制剂和PLEK siRNA3共转染组。上述各组用相应试剂处理细胞48 h后,采用qPCR检测A375细胞中miRNA-181b-5p和PLEK mRNA的表达,Western印迹检测PLEK蛋白的表达,Transwell小室侵袭实验检测A375细胞的侵袭能力;继续培养24 ~ 96 h后,CCK8实验检测A375细胞增殖能力。结果 PLEK为CM的核心基因,CM原位癌组织较癌旁组织高表达PLEK（P = 0.031）,转移组织较原位癌组织高表达PLEK（P = 0.001）。与人表皮黑素细胞HEMa-LP相比,A375细胞高表达PLEK mRNA（3.884 ± 0.156比0.997 ± 0.010,t = 18.48,P < 0.001）及PLEK蛋白（2.840 ± 0.301比1.029 ± 0.094,t = 5.47,P = 0.005）,低表达miRNA-181b-5p（0.333 ± 0.042比0.967 ± 0.069,t = 7.83,P = 0.001）。双荧光素酶报告基因实验显示,miRNA-181b-5p和PLEK靶向结合。与模拟物阴性对照相比,miRNA-181b-5p模拟物转染后A375细胞的存活率显著降低（48 h,t = 7.96,P = 0.015;72 h,t = 7.50,P = 0.002;96 h,t = 7.96,P = 0.001）,侵袭能力也显著降低（t = 5.07,P = 0.007）;相反miRNA-181b-5p 抑制剂组A375细胞存活率高于抑制剂阴性对照组（24 h,t =5.38,P = 0.013;48 h,t = 5.36,P = 0.013;72 h,t =7.63,P = 0.005;96 h,t =5.99,P = 0.004）,侵袭能力也高于抑制剂阴性对照组（t = 7.24,P = 0.002）;与对照siRNA组相比,PLEK siRNA转染后A375细胞的增殖能力降低（48、72、96 h时,P值分别为0.015、0.011、0.001）,侵袭能力也降低（t = 4.93,P = 0.008）;与miRNA-181b-5p 抑制剂和对照 siRNA共转染组相比,miRNA-181b-5p 抑制剂和PLEK siRNA共转染组A375细胞的增殖率明显降低（24、48、72、96 h时,P值分别为0.042、0.042、0.037、0.017）,侵袭能力也明显降低（t = 8.52,P = 0.001）。结论 miRNA-181b-5p抑制A375细胞增殖和侵袭能力,其机制涉及靶向下调PLEK的表达。     

非小细胞肺癌组织中高表达的miR-1269 对肺癌细胞A549 生物学行为的影响

目的:探讨miR-1269 在非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）组织中的表达和对人NSCLC A549 细胞生物学特性的影响及其作用机制。方法：选取2017 年1 月至2018 年1 月在河北医科大学第四医院胸外科进行首次手术切除的34例新鲜NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织,应用qRT-PCR 检测NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织中miR-1269 的表达水平。将miR-1269 mimics 和mimics NC转染至A549 细胞后,应用MTS实验、细胞划痕实验和Transwell 实验检测A549 细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术检测其细胞周期的变化。生物信息学软件预测miR-1269 的靶基因,并通过Western blotting 和双荧光素酶报告基因实验验证miR-1269 对靶基因的调控作用。采用Western blotting 检测已转染的A549 细胞的细胞周期依赖性激酶抑制剂p21、细胞周期蛋白D2 以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白ZEB2 和E-cadherin 的表达情况。结果：NSCLC癌组织中miR-1269 的表达水平显著高于对应的癌旁组织（2.81±2.27 vs 1.61±1.36,P<0.05）。miR-1269 mimics 转染组A549 细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著高于空白对照组和mimics NC转染组（均P<0.01）。转染miR-1269-mimics 的A549 细胞S期细胞比例明显高于mimics NC转染组[ （46.54±1.57）% vs（23.32±3.15）%,P<0.01]。miR-1269 可与FOXO1 基因3’端非翻译区的结合位点相结合,且过表达miR-1269 后,A549 细胞中FOXO1 的表达水平及荧光素酶报告基因的活性均明显降低（均P<0.01）。miR-1269 mimics 转染组A549 细胞中p21、E-cadherin 蛋白表达水平降低（均P<0.05）,而CyclinD2、ZEB2 蛋白表达水平升高（均P<0.05）。结论：miR-1269 在NSCLC组织中表达上调,并且能够促进A549 细胞的增殖、迁移、侵袭能力和影响细胞周期进程;其作用机制可能与靶向调控抑癌基因FOXO1 的表达有关。     

大鼠肝脏发育成熟及癌变时miR-100的表达

目的：探讨microRNA-100(miR-100)在大鼠肝脏发育成熟和癌变时的表达。方法取新生SD乳鼠、成年SD大鼠肝组织以及经连续喂饲2-乙酰氨基芴加部分肝切除术(2-AAF/PH)诱导的SD大鼠肝癌组织,分别采用实时荧光定量PCR及FISH技术检测miR-100的表达。结果同新生SD乳鼠相比,miR-100在成年SD大鼠肝组织中表达明显升高( P<0．05)。大鼠肝脏癌变组织的miR-100表达较成年大鼠肝组织明显下降( P<0．05),接近于新生SD乳鼠miR-100的表达水平。结论 miR-100可作为SD大鼠肝脏发育成熟的标志,其表达降低可能与肿瘤形成有关。     

Hypoxic Lung-Cancer-Derived Extracellular Vesicle MicroRNA-103a Increases the Oncogenic Effects of Macrophages by Targeting PTEN

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