MicroRNA-424在肿瘤发生中的作用和机制研究进展

MiR-424是miR-16家族成员。近年研究表明miR-424与肿瘤的发生、发展及治疗预后密切相关。本文对miR-424在乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌及结直肠癌等多种肿瘤及白血病中的表达变化、作用及机制进行综述。研究发现miR-424的表达受多种因素的影响,miR-424可作为肿瘤诊断、分期、预后的生物标记物,可用于明确肿瘤范围,也可作为肿瘤的治疗靶物。     

miR-21通过下调PTEN表达促进肝癌细胞增殖、侵袭及迁移

目的 探讨miR-21在肝癌组织中的表达、临床意义及可能的分子机制。方法 实时定量PCR检测miR-21在肝癌及癌旁组织中的表达,MTT法检测MHCC-97H细胞的增殖,Transwell实验检测MHCC-97H细胞的侵袭及迁移,Westernblot法检测miR-21下游潜在靶点PTEN的表达。结果 miR-21在肝癌组织中表达水平显著高于相应癌旁组织;肝癌组织中miR-21高表达与肿瘤大小、TNM分期、门静脉侵犯及Edmondson分级显著相关;高表达miR-21患者3年生存率明显低于低表达组;miR-21可显著促进MHCC-97H细胞的增殖、侵袭及迁移,并下调PTEN的蛋白水平。结论 miR-21在肝癌组织中表达显著上调并与肝癌恶性临床病理特征有关,miR-21促进肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用可能与下调PTEN表达有关。     

血清miR-27与老年2型糖尿病下肢血管病变及25（OH）D3水平的关系

目的分析血清miR-27与老年2型糖尿病下肢血管病变及25(OH)D3水平的关系。方法选取2017年10月-2019年5月河北省沧州市人民医院内分泌科确诊老年2型糖尿病患者86例为T2DM组,并以有无下肢血管病变分为下肢血管病变(LLPAD)亚组44例和非下肢血管病变(Non-LLPAD)亚组42例;选择同期医院门诊健康体检者76例为对照组,测定比较各组血清miR-27 mRNA表达及TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c、FPG、25(OH)D3、hs-CRP、Fib水平。结果 T2DM组miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平高于对照组,25(OH)D3、HDL-C水平低于对照组(t=13.371、13.036、25.364、19.698、29.326、38.489、95.524、66.547,66.241、8.698,P均=0.000);LLPAD亚组miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平高于Non-LLPAD亚组,25(OH) D3、HDL-C水平低于Non-LLPAD亚组(t=5.275、13.541、26.541、8.965、20.146、14.548、14.369、23.654、7.711、9.491,P均=0.000);miR-27 mRNA与25(OH)D3、HDL-C呈负相关(r=-0.486、-0.483,P=0.039、0.039),与TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG呈正相关(r=0.651、0.572、0.494、0.747、0.438、0.523、0.591,P均<0.05);高水平的miR-27 mRNA、TC及低水平的25(OH)D3均为老年2型糖尿病合并下肢血管病变发生的危险因素(OR=2.43.7、4.268、13.625,P<0.05);miR-27 mRNA、25(OH)D3两者的AUC相近,均小于TC;miR-27 mRNA、25(OH)D3诊断老年2型糖尿病下肢血管病变的敏感度、特异度相近(P>0.05),均小于TC(P<0.05)。结论老年2型糖尿病下肢血管病变患者血清miR-27 mRNA水平升高,与25(OH)D3呈负相关;miR-27、25(OH)D3诊断2型糖尿病下肢血管病变具有较高的敏感度、特异度,可作为判定2型糖尿病下肢血管病变的生物学标志物。     

miR-802靶向Hnf1B抑制胰岛素分泌的作用研究

探究miR-802对于胰岛β细胞分泌胰岛素的影响及其作用机制。利用miR-802类似物及miR-802抑制剂分别在胰岛原代细胞及Min6细胞过表达或敲降miR-802;采用ELISA法检测miR-802对胰岛素分泌的影响;通过miRNA靶基因数据库预测、荧光素酶报告法和Western blot法确证miR-802的靶基因;最后开展功能回复实验阐明miR-802调控胰岛β细胞分泌胰岛素的作用机制。结果表明:在胰岛原代细胞和Min6细胞中过表达miR-802能抑制胰岛β细胞分泌胰岛素;qPCR和Western blot实验证明miR-802通过抑制靶基因肝细胞核因子1B(hepatocyte nuclear factor 1β,Hnf1B)的转录和翻译,从而抑制胰岛素的分泌。     

MiR-744-5p通过靶向 CCND1 抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移

目的 探讨miR-744-5p/CCND1轴在肾透明细胞癌(ccRCC)中的作用及机制。方法 qRT-PCR检测ccRCC组织和细胞系中miR-744-5p 的表达水平。实验分组：miR-744-5p 模拟物（miR-744-5p mimic）、阴性对照（NC mimic）、CCND1 模拟物（CCND1 mimic）及其阴性对照（NC mimic）。CCK-8实验、划痕愈合实验和transwell实验验证miR-744-5p对ccRCC细胞增殖、迁移及侵袭功能的影响。通过生物信息学预测miR-744-5p的下游靶分子,qRT-PCR和Western blot验证CCND1在786-O及OSRC2细胞中的表达水平,双荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-744-5p和CCND1的关系,最后通过回复实验验证miR-744-5p/CCND1轴在ccRCC中的作用。结果 MiR-744-5p在ccRCC组织和细胞系中显著下调（P<0.05）,过表达miR-744-5p可以抑制ccRCC细胞的增殖、迁移和侵袭（P<0.05）。生物信息学分析结果和双荧光素酶报告基因实验结果显示,CCND1是miR-744-5p的下游靶标。回复实验结果显示,上调CCND1可以部分逆转上调miR-744-5p对ccRCC细胞增殖、迁移以及侵袭的抑制作用（P<0.05）。结论 miR-744-5p通过靶向CCND1抑制ccRCC细胞的恶性表型,miR-744-5p/CCND1轴可能是ccRCC诊断和治疗的一个新的靶点。     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

miR-29a促进人乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的机制

探讨微小核酸miRNA-29a对人乳腺癌细胞MCF-7体外迁移和侵袭的促进作用及其机制。采用miR-29a模拟物及miR-29a抑制剂分别上调和下调miR-29a的表达;采用细胞划痕法和Transwell小室法检测miR-29a对细胞迁移和侵袭能力的影响;采用Targetscan7.1数据库预测miR-29a的靶基因;荧光素酶报告法验证miR-29a的靶基因;Western blot和实时荧光定量PCR验证其表达结果。结果表明:miR-29a可显著促进MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。Targetscan软件预测HBP1可能为miR-29a的靶基因,荧光素酶报告实验显示miR-29a靶向HBP1基因的3′-UTR区。Western blot和实时荧光定量PCR结果显示,miR-29a下调了HBP1蛋白水平的表达,而mRNA水平则无明显变化。研究结果揭示在乳腺癌中高表达的miR-29a通过下调HBP1,从而使乳腺癌细胞获得高的迁移和侵袭能力,促进乳腺癌的转移。     

血清外泌体miR-451a在弥漫大B细胞淋巴瘤治疗监测中的意义

目的 探索血清外泌体miR-451a在弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma, DLBCL）中的水平及其在治疗监测中的价值。方法 本研究共纳入56例DLBCL患者,56例健康对照者。收集新发DLBCL患者治疗前、化疗2~4疗程及化疗结束后血清样本,并同时收集健康人血液标本, 提取血清中的外泌体RNA,并进行实时荧光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR）,用受试者工作特征（receive operator characteristic, ROC）曲线判定miR-451a的诊断效能,用各时点收集的血清样本动态分析血清外泌体miR-451a水平与化疗效果之间的关系。结果 56例DLBCL患者与56例健康对照者相比,DLBCL患者血清外泌体miR-451a水平下降（P<0.000 1）,在两组受试者间用miR-451a诊断DLBCL的曲线下面积(AUC)为0.737（95%CI0.645~0.816）。在随访到的43例DLBCL患者中,化疗后获得完全缓解或者部分缓解的患者其血清外泌体miR-451a水平较化疗前有所上升（P<0.05）,与配对的健康人水平差异无统计学意义（P>0.05）;化疗后未获得缓解的患者,其血清外泌体miR-451a水平较化疗前无明显变化（P>0.05）,且仍然低于配对的健康人水平（P<0.05）;化疗完成后在未缓解者与缓解者之间进行鉴别,血清miR-451a的AUC为0.867（95%CI0.728~0.951）。结论 血清外泌体miR-451a水平动态监测有助于DLBCL化疗过程中的疗效（是否缓解）判断。     

肺鳞癌中miR-144靶基因预测及其生物信息学分析

目的:分析miR-144靶基因在肺鳞癌中参与的信号通路生物过程。方法:分析The Cancer Genome Atlas网站中肺鳞癌患者的miR-144的表达量及生存曲线;预测miR-144靶基因并通过表达数据筛选影响肺鳞癌进展基因;BinGo软件对候选靶基因进行GO注释分析,利用DAVID网站预测其信号通路。结果: miR-144表达量高有利于延长肺鳞癌患者生存时间。综合4个靶基因数据库发现miR-144有72个预测结果,其中45个在肺鳞癌患者癌与癌旁组织间表达存在差异。其中部分候选靶基因参与胞核及星形微管的组成,参与上皮细胞增生、RNA合成。通路分析显示部分候选靶基因参与Ras、Wnt、Hippo等信号通路。结论:45个miR-144候选靶基因通过多条信号通路及生物过程调节细胞生命活动,影响肿瘤患者生存预期。     

不同miR-146a表达条件下Treg细胞体内回输对小鼠心脏移植免疫排斥反应的影响

目的:本研究探讨调控miR-146a Treg细胞体内回输对小鼠心脏移植免疫排斥反应的影响。方法:流式分选Treg细胞并进行体外扩增。转染试剂分别上调和下调Treg miR-146a表达。建立小鼠心脏移植模型,设立对照组,空白Treg组,miR-146a上调组,miR-146a下调组。移植后回输Treg,观察生存曲线,病理分级,测定受体脾T细胞亚群,RT-PCR检测供心IFN-γ、IL-4、IL-17表达。结果:细胞扩增10倍后miR-146a表达无明显变化,并能有效调控miR-146a表达。回输后空白Treg组（中位生存期11 d）及上调组（中位生存期13 d）生存时间延长,病理分级降低（P<0.05）;上调组更为明显（P<0.05）;下调组（中位生存期7 d）生存时间缩短,病理分级升高（P<0.05）,Th1细胞数量（28.6%±2.7%）及供心IFN-γ表达（1.12±0.11）升高（P<0.05）。结论:体外能有效地分选和扩增Treg细胞,并保证miR-146a的表达。回输Treg明显抑制小鼠心脏移植急性排斥反应,上调组抑制功能增强,下调组抑制功能减弱。