survivin基因RNAi逆转录病毒载体设计与构建方法实验研究

目的　设计和构建survivin基因的表达si RNA逆转录病毒重组载体,探讨胶质瘤分子病因及用于基因治疗的可行性。方法　利用在线软件si Direct设计干扰survivin基因靶序列,合成回文DNA序列退火后克隆至线性化p SUPER质粒载体,重组质粒载体双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞产生病毒转染低分化SHG4 4 - 9胶质瘤细胞株。利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。Western blot测定转染后SHG4 4 - 9细胞survivin表达量。结果　p SU PER表达si RNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入6 0 bp序列与原序列一致,位置正确。测定p SUPER.retro- S1、p SU PER.retro- S2病毒滴度值分别为5 .5×10 5CFU/ m l和5 .75×10 5CFU/ ml,干扰效率分别为70 .5 %和接近10 0 .0 %。结论　survivin基因的表达si RNA逆转录病毒重组载体的构建成功,不但为研究胶质瘤分子病因和基因治疗提供了有用工具,而且也为研究高表达survivin的其它肿瘤构建了新的平台。     

重组腺病毒人内皮抑素的质量标准研究

目的: 建立重组腺病毒人内皮抑素的质量标准和检测方法. 方法: PCR法鉴定腺病毒载体的E2B区和插入基因,琼脂糖凝胶电泳检查重组病毒DNA酶切图谱.分光光度法测定病毒颗粒数,TCID50法测定病毒感染滴度.感染人肝癌细胞HepG2测定插入基因的表达量,感染人血管内皮细胞HM2测定表达产物的生物学活性.病毒的纯度分析采用A260/A280比值和HPLC法进行.采用A549细胞进行复制型腺病毒的检测.结果: 腺病毒载体E2B区和插入基因PCR扩增结果与理论相符,重组病毒DNA的酶切图谱与标准品一致.原液病毒颗粒数为2.4×1012 VP/ml,滴度为1.53×1011 IU/ml,比滴度为6.4% IU/VP;成品病毒颗粒数为1.0×1012 VP/ml,滴度为3.75×1010 IU/ml,比滴度为病3.8% IU/VP.以50 MOI重组腺病毒感染HepG2细胞48 h后培养上清人内皮抑素表达量为332 ng/ml.50 MOI重组腺病毒对血管内皮细胞生长的抑制率为55%.A260/A280为1.29,HPLC纯度为99.7%.复制型腺病毒为≤1RCA/3×1010 VP.其他各项检测指标均符合规定.结论: 建立了重组腺病毒人内皮抑素的质量标准及其检测方法,并用于该产品的质量控制.     

RhoB对胃癌细胞SGC7901的负性调控作用

目的研究RhoB对胃癌细胞SGC7901增殖调控作用。方法用PCR扩增出RhoB的全长cDNA，构建RhoB可诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB；脂质体介导法将调控载体pSwitch及诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB先后转入人胃癌细胞SGC7901中，筛选出稳定抗性克隆；Western blot检测米非斯酮诱导后转染细胞中RhoB蛋白的表达。用MTT assay检测RhoB转染细胞株的生长速度、双苯并咪唑染料(Hoechst 33258)活细胞吸收分析法、流式细胞仪(FCM)检测RhoB对胃癌细胞凋亡指数作用。结果成功构建RhoB可诱导真核表达载体pGene／V5-His-RhoB，并经酶切和测序鉴定；转染后经潮霉素B和Zeocin筛选出稳定抗性克隆SGC7901／RhoB；米非斯酮诱导出RhoB蛋白表达，在诱导24小时后蛋白表达最高；细胞增殖试验结果显示，RhoB表达上调后胃癌细胞增殖受到抑制；细胞凋亡检测提示高表达RhoB可明显诱导胃癌细胞凋亡。结论RhoB对胃癌细胞增殖具有负性调控作用，可诱导胃癌细胞出现凋亡。     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

天然内生抗菌多肽elafin真核表达载体的构建及在真核细胞的表达

采用RT-PCR法提取天然内生抗菌多肽elafin的基因，通过测序确认后亚克隆构建真核表达载体pEGFP-N1-elafin，再转染至肺上皮细胞A549，荧光显微镜观察pEGFP-N1-elafin在细胞中表达及定位，采用Northern杂交、ELISA检测法分别从转录及蛋白质水平分析表达情况，最后通过酶切电泳鉴定证实真核表达载体pEGFP-N1-elafin构建成功，其转染细胞中有elafin的基因表达，且细胞上清液中elafin含量证实其主要是分泌性表达。Elafin基因cDNA真核表达载体的成功构建以及主要呈分泌性表达的特点显示了极具意义的潜在应用价值。     

重组人Bcl-2腺病毒载体的构建与鉴定

目的　构建人bcl-2重组腺病毒载体。方法　通过酶切分析获得正向插入目的基因的真核表达载体pcDNA/bcl -2 ,然后将bcl -2定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV中 ,通过体内同源重组 ,重组质粒与质粒pJM17共转染 2 93细胞 ,获得复制缺陷型重组腺病毒AdCMV/bcl -2 ,进行扩增、纯化。通过PCR检测病毒DNA ,空斑实验检测病毒滴度。结果　腺病毒穿梭质粒与pJM17体内同源重组后获得含目的基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 2 0× 10 1 0 pfu/ml。结论　基因重组腺病毒载体能成功获得高滴度含目的基因的腺病毒     

兔角膜基质细胞在壳聚糖胶原共混膜体外培养研究

目的　探讨壳聚糖 胶原共混膜作为载体体外培养兔角膜基质细胞的可行性。方法　先同时消化角膜上皮及内皮层 ,然后刮去上皮、内皮、前弹力层和后弹力层 ,将剩余的基质层剪碎消化 ,接种在壳聚糖 胶原共混膜上 ,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养的细胞进行鉴别。结果　角膜基质细胞应用消化培养法 4h后部分基质细胞与壳聚糖 胶原共混膜有贴壁现象出现 ,细胞呈梭形。培养 2 4h后 ,基质细胞呈纺锤形且透明 ,此后细胞分裂增殖越来越多并向周围延伸 ,培养第 6天细胞已经达到完全融合状态 ,呈梭形 ,排列比较整齐。在 6d左右达到 10 0 %融合状态 ,间接免疫荧光细胞化学染色、Vim染色、胞浆染色阳性。结论　传代的细胞具有角膜基质细胞的生物特性 ,壳聚糖 胶原共混膜适合角膜基质细胞传代培养     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…     

小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

应用RT—PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm—T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

TIMP-2逆转录病毒载体的构建及表达

目的构建人组织型基质金属蛋白酶抑制剂2（TIMP-2）编码序列基因逆转录病毒表达载体，转染人单核细胞白血病细胞株，为探讨TIMP-2的生物学功能奠定基础。方法根据基因库中已公布的序列设计引物，用PCR方法扩增出人TIMP-2编码序列基因片段，用限制性内切酶及T4连接酶将目的片段插入MSCV逆转录病毒载体中。采用酶切和PCR鉴定及测序后经脂质体介导转染至PT67包装细胞中，以病毒上清感染单核细胞白血病细胞株SHI-1，G418筛选，极限稀释法挑选单克隆细胞株，定量PCR和Western Blotting检测TIMP-2的表达。结果TIMP-2基因克隆进逆转录病毒载体MSCV中，经酶切、PCR和DNA测序证实重组逆转录病毒载体构建正确，病毒上清感染SHI-1细胞，经G418筛选并挑选出单克隆细胞，经实时定量PCR和Western Blotting检测发现SHI-1细胞中TIMP-2 mRNA及蛋白表达明显上调。结论成功构建了高表达TIMP-2的SHI-1细胞，可对其生物学行为作进一步研究。