hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

hTERT mRNA和survivin mRNA在女性尖锐湿疣中的表达及其相互关系

目的:探讨hTERT mRNA和survivin mRNA在尖锐湿疣中的表达及其相互关系。方法:采用原位杂交方法检测80例尖锐湿疣和正常皮肤组织中的hTERT mRNA和survivin mRNA的表达情况。结果:尖锐湿疣中hTERT mRNA阳性表达率(66.25%)明显高于正常皮肤(20%)(P<0.05);survivin mRNA阳性表达率(55%)明显高于正常皮肤(5.0%)(P<0.05);hTERT mRNA和survivin mRNA两者的表达密切相关(P<0.01)。结论:hTERT和Survivin的过表达在CA中起着重要的作用。Survivin可导致端粒酶活化,但端粒酶激活可能不完全依赖于Survivin的调控。     

吲哚美辛和hTERT-siRNA对胆囊癌细胞的作用

目的研究吲哚美辛和hTERT-siRNA对胆囊癌细胞株GBC-SD的端粒酶活性、细胞增殖、运动的抑制作用;并试从β-catenin／hTERT信号转导途径揭示其分子机制。方法采用端粒酶TRAP、半定量RT-PCR和Western Blot印迹方法检测GBC-SD端粒酶活性、hTERT基因和β-catenin基因mRNA、蛋白质表达水平。四甲基偶氮唑盐（MTT）光吸收法检测琥珀酸脱氢酶（SDH）活性并做细胞增殖计数、运用Transwell小室和划线了解癌细胞侵袭与运动情况。结果质粒pGCsi-H1／GFP-hTERT转染GBC-SD细胞6～24h再加入吲哚美辛后对GBC-SD细胞的端粒酶、SDH活性、细胞增殖、运动、侵袭力均具有很明显的抑制作用,分别同阴性对照pGC-si-H1／NEGative联合吲哚美辛组、单用吲哚美辛组进行比较,差异有显著性（P〈0．01）。pGCsi-H1／GFP-hTERT作用于GBC-SD细胞24h再加入吲哚美辛,检测hTERT mRNA和hTERT蛋白表达,分别与pGCsi-H1／NEGative联合吲哚美辛组、单用吲哚美辛组进行比较,差异有显著性（P〈0．01）。pGCsi-H1／GFP-hTERT作用于GBC-SD细胞24h再加入吲哚美辛,检测β-catenin mRNA和p-catenin蛋白表达．分别与pGCsi-H1／NEGative联合吲哚美辛组、单用吲哚美辛组进行比较,无明显差异（P〉0．05）。结论吲哚美辛可增强hTERT-siRNA抑制GBC-SD细胞端粒酶、SDH的活性,及其增殖、运动、侵袭力,降低hTERTmRNA和hTERT蛋白表达,其机制与β-catenin／hTERT信号转导途径受抑存在一定联系。     

口腔白斑及鳞状细胞癌中c-Myc及hTERT蛋白表达的研究

目的 研究c-Myc和hTERT蛋白在口腔白斑和鳞状细胞癌中的表达及其与二者发生发展的关系。方法采用免疫组化方法检测口腔白斑48例、鳞状细胞癌4l例和lO例正常口腔粘膜组织中c-Mye和hTERT蛋白的表达,并进行统计学处理分析。结果在正常口腔粘膜组、单纯增生性白斑组、异常增生性白斑组和OSCC组c-Myc蛋白表达的阳性率分别为0（0／10）、21．43％（3／14）、52．94％（18134）、75．61％（31141）,组间差异有统计学意义（P〈0．05）;在正常口腔粘膜组、单纯增生性白斑组、异常增生性白斑组和OSCC组hTERT蛋白表达的阳性率分别为0（0／10）、7．14％（1／14）、32．36％（11／34）、58．54％（24／41）,组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论c-Myc蛋白、hTERT蛋白的表达与细胞增殖及肿瘤的发生密切相关,可能是检测OLK恶变潜能的指标。     

端粒酶hTERT mRNA在乳腺癌中的表达及与c-myc相关性分析

目的 探讨人乳腺癌中原癌基因c-myc与hTERT mRNA表达的关系.方法 收集癌旁正常乳腺组织、导管原位癌、浸润性导管癌各12、18和25例,用原位杂交法检测hTERT mRNA表达,并用免疫组织化学法检测乳腺导管癌c-myc表达.结果 ①hTERT mRNA在癌旁正常乳腺组织中未见表达,在导管原位癌、浸润癌中的阳性率分别为83.33%和88.00%,后两组hTERT mRNA表达明显高于正常组;②hTERT mRNA表达与浸润性导管癌肿块大小及淋巴结转移与否无相关性（P＞0.05）;③43例乳腺导管癌中hTERT mRNA与c-myc表达呈正相关（γ=0.388 4,P＜0.05）.结论 端粒酶hTERT的表达可能在乳腺导管癌的组织发生中起关键作用,c-myc的过度表达可能与乳腺导管癌hTERT基因转录激活有关.     

构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体

目的：构建串联的MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体。方法：将串联的MYC反应元件修饰的hTERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1克隆到穿梭质粒pDC316上，上辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在HEK293细胞中扩增重组病毒。PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度。结果：成功获得由6倍和18倍MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体。结论：MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础。     

hTERT片段真核表达质粒的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法：从肿瘤组织中提取总RNA．采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3．1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果：PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98．73％,氨基酸序列的同源性为99．68％。结论：成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的克隆及在人肝癌细胞的肿瘤特异性分析

目的:克隆hTERT基因启动子并检测其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法:采用PCR法扩增获得hTERT基因的启动子片段,将之克隆到表达虫荧光素酶基因的报告质粒上,通过测定荧光素酶报告基因的表达,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系和正常组织中的转录活性,并将之与甲胎蛋白(alpha-fetal-protein,AFP)基因启动子活性相比较,评价其作为肝癌基因治疗中应用的肿瘤特异性启动子的可行性.结果:成功克隆了hTERT启动子,证实hTERT启动子在肝癌细胞中具有相当强的转录活性,其活性水平为AFP启动子的14～30倍;在原代培养的成纤维细胞中其启动子未表现转录活性.结论:hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性和显著的肿瘤特异性,可望开发成为新型的肝癌靶向性基因治疗工具.     

HPV16感染与端粒酶hTERT、P21waf、Ki67表达在宫颈鳞状细胞癌及其癌前病变组织中的关系及意义

目的：探讨HPV16感染与端粒酶hTERT、Ki67、P21^waf表达在人类宫颈鳞癌及其癌前病变中的关系及其意义.方法：利用组织芯片技术结合原位杂交技术和免疫组织化学方法研究130例正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤样变组织和宫颈鳞癌组织中HPV16感染以及端粒酶hTERT、Ki67、P21^waf表达的情况.结果：①在8/22 CIN Ⅰ、7/11CINⅡ、11/13 CINⅢ、4/6原位癌,41/52宫颈鳞癌中为HPV16杂交信号阳性,CINⅢ、浸润性鳞癌与正常宫颈组织相比HPV 16杂交信号阳性率差异有显著统计学意义（P均＜0.05）;②从CINⅡ、CINⅢ到浸润癌hTERT表达与正常组织相比,差异皆有显著统计学意义（P均＜0.05）,且细性程度逐渐增加.hTERT表达在各级癌及癌前病变组织中与HPV16型的感染率之间也呈现出正相关性（P＜0.05,r=0.339）;③P21^waf在癌组织中的阳性率及强度都低于正常宫颈组织（P＜0.05）,且P21^waf的表达与HPV16感染、hTERT表达之间具有负相关性（P＜0.05,r=-0.337;P＜0.05,r=-0.248）;④与正常宫颈组织相比从CINⅡ到宫颈浸润性鳞癌Ki67的表达,其差异有显著统计学意义（P＜0.05）,但Ki67的表达与HPV16的感染不具有相关性（P＞0.05）,与hTERT表达之间具有相关性（P＜0.05,r=0.398）,与P21^waf呈现出负的相关性（P＜0.05,r=-0.446）.结论：HPV16感染与hTERT、P21^waf、Ki67互相作用,共同影响宫颈鳞癌的发生发展.这些指标利于阐明HPV16的恶性转化机制以及为提高宫颈鳞癌及其癌前病变诊断率提供依据.     

Pinx1、hTERT mRNA在三种皮肤肿瘤组织中的表达及意义

目的 探讨内源性端粒酶抑制基因PinX1及端粒酶逆转录酶hTERT在基底细胞癌、鳞状细胞癌、日光性角化病组织中的表达及其意义。 方法 实时定量PCR检测实验组36例3种皮肤肿瘤组织中内源性端粒酶抑制基因PinX1及端粒酶逆转录酶hTERT的mRNA表达水平,并以15例正常人皮肤组织作为对照组。 结果 实验组PinX1基因的mRNA表达水平（2.53 ± 1.57）低于对照组（4.25 ± 2.02）,差异有统计学意义（t = 3.273,P < 0.05）;hTERT基因的mRNA表达水平（6.37 ± 3.81）明显高于对照组（1.62 ± 0.99）,差异有统计学意义（t = 6.927,P < 0.05）;Pinx1的表达水平与hTERT表达的相关性无统计学意义（P > 0.05）。 结论 PinX1的下调及hTERT上调可能与3种皮肤肿瘤形成过程中端粒酶激活及维持机制有关。