健康人肝组织麦胚凝集素亲和型糖蛋白表达谱分析

目的分析健康人肝组织麦胚凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)亲和型糖蛋白表达谱。方法从30例健康人肝组织混合样本的总蛋白中用WGA凝集素亲和层析分离纯化糖蛋白,再利用双向电泳结合SYPRO Ruby荧光染色进一步分离WGA亲和型糖蛋白。目的蛋白质点经质谱鉴定后对其进行生物信息学分析及功能分类。结果初步建立WGA亲和型糖蛋白的双向电泳图谱,图谱均点数为(650±50)个,质谱鉴定并去冗余共获116个蛋白。经生物信息学分析104个蛋白具有不同程度的N糖基化位点,最后按Gene Ontology的分类原则进行功能分类。结论凝集素亲和层析结合双向电泳荧光染色、质谱鉴定是一种高通量的检测方法,WGA亲和型糖蛋白表达谱的初步构建为后续研究奠定了基础。     

乙肝病毒感染者血清抗核抗体特征及其临床相关性

目的分析乙肝病毒(HBV)感染者血清中抗核抗体(ANA)的特征并探讨其与临床的相关性。方法慢性乙型肝炎(CHB)、乙肝后肝硬化(LC)、原发性肝癌(HCC)患者共569例,采用间接免疫荧光法(IIF)检测ANA、AMA、SMA、LSP等自身抗体;免疫印迹法检测ANA谱。结果1)569例中ANA阳性245例(43%),CHB、LC、HCC组ANA检出率分别为42.1%(90/214)、38.2%(108/283)、65.3%(47/72),3组均明显高于正常对照组6.7%(2/30),HCC组ANA阳性率显著高于CHB组和LC组(P<0.01)。2)CHB、LC和HCC组ANA以低滴度(1∶100)为主,分别为75.6%(68/90)、68.5%(74/108)、66%(31/47)。3组中ANA荧光模式以颗粒型常见;抗核仁型抗体的比例在HCC组中最高为19.1%(9/47)。3)45例ANA≥1∶320的患者检测了ANA谱,仅2例LC患者dsDNA阳性,1例LC患者SSA阳性,余患者阴性。4)ANA滴度1∶100组与≥1∶320组的ALT、AST、HBVDNA各指标比较,差异无统计学意义。结论HBV感染者出现的自身抗体以ANA为主,HCC组阳性率最高。ANA荧光模式以颗粒型常见,核仁型在HCC和LC组高于CHB组。70.6%的HBV感染者ANA为低滴度阳性,其滴度的高低与肝细胞损伤未见明显相关性。     

绿色荧光蛋白标记骨髓基质干细胞在恒河猴体内构建组织工程骨的示踪作用

目的 用绿色荧光蛋白(GFP)标记恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC),以示踪其在体内参与组织工程骨形成的情况.方法 用OBI-293A细胞对腺病毒Ad5.CMV-GFP进行扩增,用Ad5.CMV-GFP转染rBMSc,将转染成功的第三代BMSc在转染后48 h消化制成细胞悬液,接种至块状可吸收HA上,体外培养3 d后,将其植入恒河猴(同体移植)背阔肌的肌袋内,以未转染GFP的BMSC用同样的方法接种块状可吸收HA上,作为对照,术后6周取材,4%的中性多聚甲醛固定,塑料包埋,制作骨磨片PI染色在激光共聚焦显微镜下进行观测.结果 转染GFP后,rBMSc仍贴壁生长,呈梭形或多角形,仍分裂增殖,但增殖速度有所降低.48 h可见细胞发出强烈的荧光,呈全细胞分布,计数转染率达80%.在激光共聚焦显微镜下观察骨磨片,可见材料内有发出较强荧光的细胞结构,能同时被PI染液着色.结论 绿色荧光蛋白能有效示踪组织工程骨种子细胞,种人体内的BMSC是组织工程骨骨组织形成的主要细胞来源.     

RNA干扰技术抑制鼻咽癌细胞内源性绿色荧光蛋白的表达

目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的鼻咽癌细胞株;观察不同转染浓度的短发卡状RNA对鼻咽癌细胞内源性GFP的抑制效率及细胞毒性.方法:转染pEGFP-N1至鼻咽癌细胞株HNE1,G418筛选获得稳定表达GFP的HNE1-GFP细胞株;利用针对GFP基因的短发卡状RNA表达载体shGFP,以不同浓度shGFP转染HNE1-GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,软件分析荧光抑制效率,MTT检测细胞毒性,RT-PCR检测GFPmRNA水平改变,Western Blot检测GFP蛋白水平改变.结果:绿色荧光稳定表达于传代HNE1细胞中;shGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达,抑制效率分别为49.7%,84.8%,86.7%且无细胞毒性;GFP在mRNA和蛋白水平的表达均有明显下降.结论:稳定表达GFP的鼻咽癌细胞株成功建立;RNA干扰载体可抑制鼻咽癌细胞中GFP的表达,其抑制效率有明显的浓度依赖性且无明显细胞毒性.该系统能够用于鼻咽肿瘤的RNA干扰机制研究中.     

深圳市首例人禽流感病例的实验室检测分析

目的对深圳市首例人禽流感病例进行实验室确诊，并研究其携带病毒关键基因的遗传特性。方法采用实时荧光RT-PCR方法检测高致病性禽流感病毒（H5N1）核酸，采用血凝抑制方法检测患者血清抗高致病性禽流感病毒的抗体滴度变化，利用MEGA3．1软件分析患者携带病毒HA、NA基因的进化关系。结果成功确认了深圳市首例人禽流感病例，患者携带病毒为H5N1高致病性禽流感病毒，HA、NA基因进化关系比较特殊。结论深圳地区禽鸟中可能携带高致病性禽流感病毒，具有潜在感染人类的可能。     

信号传导与激活因子2基因在食管癌中的表达

目的:筛选食管癌中特异表达的基因,进一步了解食管癌发生的分子机制。方法:利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异表达的片段,对这些片段进行克隆和序列分析。通过在基因库中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因。利用实时荧光定量PCR技术在食管癌临床标本中进行验证。结果:通过DD-PCR获得的差异片段中有一个片段对应于信号传导与激活因子2(stat2)基因,该基因的读码框长2556 bp,编码852个氨基酸,编码蛋白分子量约97.9 kD。应用实时荧光定量PCR方法进一步验证发现该基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织(P<0.05,n=16)。结论:stat2基因在食管癌组织中呈高表达,推测其可能在食管癌的发生发展中起一定的作用。     

外周血表皮生长因子受体和LUNX mRNA表达对肺癌微转移诊断的价值

目的:分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者和肺良性病变患者外周血表皮生长因子受体(EGFR)mRNA和LUNX mRNA表达情况,探讨其在肺癌微转移诊断中的价值.方法:采用荧光定量PCR方法检测42例肺癌患者和18例肺良性疾病患者外周血EGFR mRNA和LUNX mRNA表达.结果:42例NSCLC患者EGFR mRNA表达的阳性率为45.2%(19/42),LUNX mRNA表达的阳性率为40.5%(17/42),两者联合检测阳性率可提高到64.3%.良性肺部疾病患者均为阴性.结论:EGFR mRNA和LUNX mRNA可作为检测NSCLC患者外周血微转移的分子标志物,联合检测可提高外周血癌细胞的检出率.     

腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)的表达。方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

基于硅酞菁的新型光敏聚苯乙烯微球的原位共聚合成

以3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯（MPS）修饰的二羟基硅酞菁（SiPc（OH）₂）为荧光单体（SiPc,OSi（C₉H₁₇O₄）₂）、过硫酸钾（KPS）为引发剂、十二烷基硫酸钠（SDS）为乳化剂,采用原位共聚法合成了一种新型单分散聚苯乙烯荧光微球（P（St-co-SiPc））。采用扫描电镜、傅里叶红外光谱对微球的形貌与组成进行了分析与表征,并对合成条件进行了优化。研究了荧光单体与苯乙烯的用量、反应温度对微球形貌与荧光性能的影响。在此基础上,利用紫外光谱进一步研究了该微球的光敏特性。结果表明,柔性不饱和侧链修饰的硅酞菁单体与苯乙烯的相容性良好,合成的荧光微球具有优异的稳定性与光学性能。