体外重建组织工程关节软骨的实验研究

目的　用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行软骨细胞三维立体培养 ,构建人工软骨组织。方法　取 2周龄的新生兔关节软骨 ,经消化 ,将获得的软骨细胞与牛 型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合 ,制成软骨培养物并在体外培养。培养第 3周时 ,取材进行 HE、甲苯胺蓝染色和透射电镜检查。结果　体外培养 3周 ,培养物内细胞均存活 ,形成软骨陷窝 ,同源性细胞簇出现 ,并分泌软骨基质。透射电镜下可见丰富的粗面内质网和线粒体 ,及少量的高尔基复合体。结论　用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞 ,可构建较大的组织工程软骨     

Glycosaminoglycans in the pericellular matrix of chondrons and chondrocytes

This is the first study to quantitate and profile the glycosaminoglycan (GAG) composition of the pericellular matrix (PCM) of chondrons and chondrocytes using the highly sensitive technique; fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE). Bovine articular chondrocytes and chondrons were isolated enzymatically. High cell yield and viability were obtained for both preparations. Chondrons had strong immunofluorescent labeling for keratan sulphate and chondroitin-6 sulphate but no labeling for hyaluronan. We compared the immunofluorescent data with FACE. The quantities of total keratan sulphate were determined to be 0.013 +/- 0.002 pg cell(-1) and 0.032 +/- 0.003 pg cell(-1) in the chondrocyte and chondron preparations, respectively. Four internal keratan sulphate sugars were detected (gal beta 1,4glcNAc6S, gal6S beta 1,4glcNAc6S, glcNAc beta 1,3gal and glcNAc6S beta 1,3gal) for both preparations but they were present at significantly higher concentrations in chondron preparations (P < 0.01). Total chondroitin sulphate (CS) was determined to be 0.054 +/- 0.004 pg cell(-1) and 0.077 +/- 0.005 pg cell(-1) for chondrocyte and chondron preparations, respectively. Unsulphated CS disaccharide levels were similar but chondrons had significantly more chondroitin-4 sulphated disaccharides and chondroitin-6 sulphated disaccharides (P < 0.05). Hyaluronan acid was present at low concentrations (0.010 +/- 0.001 pg cell(-1)) in both chondrocytes and chondrons. In this study, enzyme digestion coupled with FACE separation revealed new information about the differences in GAGs from isolated chondrocyte and chondron preparations. Further investigation of the differences in GAGs from chondrocytes and chondrons from different zones of articular cartilage may be useful for tissue engineering approaches.     

纳米HA/CS支架穿“靴”复合软骨样细胞修复兔关节软骨和软骨下骨缺损

【目的】观察把骨髓间质干细胞(BMSCs)诱导成的软骨细胞与纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(nano-HA/CSscaffold)通过特殊的穿"靴"结构复合构建而成组织工程软骨复合体的可行性,并观察此复合体修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺损的能力。【方法】原位复合和冷冻干燥相结合的方法制备nano-HA/CS支架,用聚四氟乙烯制作成圆柱形"靴"结构。把BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后,接种于穿"靴"的nano-HA/CS支架底部,把细胞-支架复合物置入成软骨条件培养液中培养2周。扫描电镜观察nano-HA/CS支架结构及细胞-支架复合体结构。30只新西兰大白兔的股骨髁制造直径4 mm、深8 mm的骨软骨缺损,随机分为实验组、对照组、空白组,于缺损处分别植入经穿"靴"结构复合的软骨支架复合体、不经穿"靴"结构复合的软骨支架复合体,空白组仅造缺损,4、12周后取材初步观察修复情况。【结果】BMSCs经软骨诱导液诱导后转化成软骨细胞;制备的nano-HA/CS支架支架孔隙率为92%,平均孔径为125μm,与软骨细胞有较好的粘附性。大体观察实验组和对照组缺损均有类软骨样组织生长,空白组缺损明显,见纤维组织生长。苏木精-伊红染色切片观察实验组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复,两者耦合处部分交叉,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于对照组和空白组。3组的大体评分和软骨组织学评分统计分析,实验组优于对照组和空白组。【结论】BMSCs具有成软骨潜能,nano-HA/CS支架具有较好的细胞相容性;软骨细胞与nano-HA/CS支架经过穿"靴"结构可成为组织工程软骨复合体,并初步证实有修复兔软骨及软骨下骨缺损的能力。     

淫羊藿醇提工艺及醇提物对软骨细胞保护作用的研究

选取淫羊藿所含主要活性成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的转移率为评价指标,采用均匀设计-综合评分法考察乙醇用量、乙醇浓度、提取时间等因素的影响,通过多元线性逐步回归优选条件参数,经验证试验确定淫羊藿醇提工艺条件。并根据该工艺条件制备淫羊藿醇提物,干预白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞损伤模型,采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测软骨细胞的凋亡率,分析淫羊藿醇提物对软骨细胞损伤模型的影响。优化的淫羊藿醇提工艺条件为:取淫羊藿粗粉,加入18倍量70%乙醇溶液,回流提取2次,每次提取60 min,在该工艺条件下朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的提取率分别达到94.21%,94.76%,93.85%,96.17%,96.85%,淫羊藿醇提工艺合理、可行,重现性好。所制得的淫羊藿醇提物能显著降低IL-1β诱导软骨细胞损伤模型的早期凋亡率、晚期凋亡和坏死率、总凋亡率(P<0.05或P<0.01),提示淫羊藿醇提物对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡具有一定抑制作用,可为深入研究其对骨关节炎的防治作用奠定基础。     

Hh信号通路在氟致大鼠原代软骨细胞损伤中作用

目的探讨体外染氟软骨细胞中刺猥蛋白基因(Hh)信号通路中音速刺猬蛋白、跨膜蛋白(Smo)及下游骨形态发生蛋白-2(BMP-2)因子表达在氟中毒软骨细胞损伤中的作用。方法取1周龄健康SD大鼠, 用机械、酶消化法分离膝关节软骨细胞, 免疫细胞化学对原代软骨细胞进行鉴定。实验设对照组和染氟组(5、10、20、40 mg/L)。培养48 h后, 噻唑蓝法检测各组细胞活力, 蛋白印迹及逆转录PCR分别检测各组细胞Smo、Shh、BMP-2蛋白及mRNA表达;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果与对照组比较, 5、10 mg/L染氟组细胞活力[分别为(113.33±11.74)%、(127.25±10.24)%]明显升高, 40 mg/L染氟组细胞活力[(73.91±9.94)%]明显下降(P<0.05);染氟组细胞中Shh、Smo、BMP-2蛋白和mRNA的表达量随染氟浓度增加而升高;40 mg/L染氟组细胞凋亡率为(11.13±1.20)%, 明显高于对照组。结论氟可激活软骨细胞中Hh信号通路, Hh信号通路与软骨细胞凋亡可能共同参与氟中毒软骨损害过程。     

过氧化氢对关节软骨细胞过氧化损伤效应及中药黄芪干预实验研究

目的 观察过氧化氢对体外培养兔膝关节软骨细胞过氧化损伤效应及中药黄芪(astragalus)的干预作用,探讨黄芪抗氧化损伤作用机制.方法 兔膝关节软骨细胞原代培养,采用Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光法进行鉴定.分为正常对照组(正常组)、过氧化氢损伤对照组(损伤组)和过氧化氢损伤加黄芪干预组(黄芪组).损伤组采用终浓度 0.2mmol/L的过氧化氢制造体外软骨细胞过氧化损伤模型,黄芪组将终浓度分别为 0.02、0.1、0.5g/L的黄芪于过氧化氢损伤前 60min加入.测定各组细胞活力(MTT法)、细胞凋亡率(流式细胞术)、蛋白含量(考马斯亮蓝法)、培养上清液中丙二醛(MDA)含量(硫代巴比妥酸法)和SOD活性(邻苯三酚自氧化法).结果 与正常组比较,损伤组细胞活力显著降低、细胞凋亡率增加、蛋白含量下降、培养上清液中MDA水平显著上升、SOD活性和蛋白含量显著下降.黄芪组与损伤组比较,细胞活性显著升高、培养上清液中MDA水平显著降低、SOD活性和蛋白含量显著上升.结论 过氧化氢能造成体外软骨细胞显著的过氧化损伤,黄芪能抵抗体外软骨细胞过氧化损伤.     

Investigation of the molecular causes underlying physical abnormalities in Diamond-Blackfan anemia patients with RPL5 haploinsufficiency

Diamond-Blackfan anemia (DBA) is a genetic disorder caused by mutations in genes encoding ribosomal proteins and characterized by erythroid aplasia and various physical abnormalities. Although accumulating evidence suggests that defective ribosome biogenesis leads to p53-mediated apoptosis in erythroid progenitor cells, little is known regarding the underlying causes of the physical abnormalities. In this study, we established induced pluripotent stem cells from a DBA patient with RPL5 haploinsufficiency. These cells retained the ability to differentiate into osteoblasts and chondrocytes. However, RPL5 haploinsufficiency impaired the production of mucins and increased apoptosis in differentiated chondrocytes. Increased expression of the pro-apoptotic genes BAX and CASP9 further indicated that RPL5 haploinsufficiency triggered p53-mediated apoptosis in chondrocytes. Murine double minute 2 (MDM2), the primary negative regulator of p53, plays a crucial role in erythroid aplasia in DBA patient. We found the phosphorylation level of MDM2 was significantly decreased in RPL5 haploinsufficient chondrocytes. In stark contrast, we found no evidence that RPL5 haploinsufficiency impaired osteogenesis. Collectively, our data support a model in which RPL5 haploinsufficiency specifically induces p53-mediated apoptosis in chondrocytes through MDM2 inhibition, which leads to physical abnormalities in DBA patients.     

模拟微重力环境下威灵仙维持兔膝关节软骨细胞表型的效应与机制

目的 研究模拟微重力培养环境下威灵仙提取物对兔软骨细胞表型维持的作用及机制。方法 利用液动力聚焦细胞培养系统体外模拟微重力培养环境,同时使用威灵仙提取物进行干预,将兔膝关节软骨细胞分为空白组(平面培养)、威灵仙组(平面培养+威灵仙提取物)、微重力组(微重力培养)、微重力-威灵仙组(微重力培养+威灵仙提取物)4组,培养7 d;观察各组软骨细胞形态学变化,CCK-8检测各组细胞增殖活性,流式细胞技术检测各组软骨细胞凋亡率;RT-qPCR检测成软骨相关mRNA Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖、TGF-β、SOX9,以及与软骨去分化相关mRNA MMP13、Ⅰ型胶原蛋白;Western blotting检测Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、TGF-β及MMP13蛋白表达;同时对细胞内葡萄糖、ATP、乳酸含量进行检测,评估各组软骨细胞能量代谢状态。结果 形态学观察显示微重力组、微重力-威灵仙组软骨细胞保持良好形态,空白组、威灵仙组梭形细胞增多。与空白组相比,模拟微重力培养条件与威灵仙提取物均能提高软骨细胞48,72 h的增殖活性,降低细胞凋亡率,上调蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、TGF-β的蛋白及mRNA表达,降低MMP13的蛋白及mRNA表达,上调SOX9 mRNA表达,降低Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达,上调软骨细胞内葡萄糖、ATP、乳酸含量,两者结合效果最为显著(P < 0.01)。结论 模拟微重力培养环境与威灵仙提取物均能够促进软骨细胞能量代谢,保持增殖活性以及软骨细胞表型维持,而二者联合应用可以发挥协同作用。     

山羊骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞诱导分化

目的 探讨体外分离、培养山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs),并将其诱导分化为软骨细胞表型,明确其向软骨细胞分化的能力.方法 抽取10月龄健康中国青山羊骨髓,贴壁法培养BMSCs,体外培养至第4代时进行流式细胞术鉴定,并加入成软骨诱导培养基,其成分包括10% FBS高糖DMEM培养基、6.25 μg/ml 胰岛素、6.25 μg/ml 转铁蛋白、50 μmol/ml抗坏血酸、100 nmol/L地塞米松及10 ng/ml TGF-β1.分别于0、1、2、4周行细胞化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹试验(Western blot)检测II型胶原和Aggrecan的表达.结果 山羊BMSCs生长良好,传至第4代时细胞纯度较高.加入诱导培养基后,山羊BMSCs在1、2、4周均可看到软骨细胞表型的表达,并且随着时间的延长,其II型胶原及Aggrecan基因和蛋白的表达量逐渐增加,2周时即可达到较好的诱导效果.结论 本实验采取一种简易的方法 分离、培养并向软骨细胞方向诱导分化山羊BMSCs,证实其具有分化为软骨细胞的潜能,为山羊用于骨软骨组织工程的体内研究提供了实验基础.     

不同循环静压力对兔软骨细胞整合素α1β1的影响

目的观察不同循环静压力对兔关节软骨细胞增殖及其分泌整合素α1β1浓度的影响。方法体外分离培养胎兔关节软骨细胞,取第2代细胞接种到培养板,分别设置正常压力组(正常压力)、高压力1组(172 kPa)和高压力2组(345 kPa),每天干预2 h。连续干预72 h后,以WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测各组细胞吸光度值(OD值),以酶联免疫吸附法检测各组培养上清中整合素α1β1浓度。结果高压力1组与正常压力组比较,OD值和整合素α1β1浓度差异均有统计学意义(P<0.05);高压力2组与正常压力组比较,整合素α1β1浓度差异均有统计学意义(P<0.05);高压力2组与高压力1组比较,OD值和整合素α1β1浓度差异均有统计学意义(P<0.05)。结论低水平循环静压力对软骨细胞的增殖具有促进作用,而高水平循环静压力则表现为抑制作用;细胞增殖情况和其分泌整合素α1β1浓度可能呈负相关关系。