Wnt10b诱导再生毛囊的表达特性研究

目的 研究Wnt10b诱导再生毛囊的表达特性及诱导作用机制。 方法 HEK-293细胞内扩增并用氯化铯梯度离心纯化Wnt10b过表达腺病毒及对照腺病毒,皮内注射至C57BL/6J小鼠背部皮肤,在处理后2.5、5、7、9、14、28 d时取材,HE染色及免疫组化染色观察毛囊结构特征、信号通路表达特征及增殖特性。 结果 HE染色发现,AdWnt10b处理组从第5天开始出现新生毛囊结构,正常生长,第28天左右进入退化期。免疫组化染色发现,AdWnt10b处理组从处理后5 d开始新生毛囊具有AE15表达,随着毛囊生长而增加,至处理后28 d开始减少。在AdWnt10b处理后5 d,观察到β连环素的核表达,Lef1特异性表达于毛芽和毛母质部位,且全为核表达。在AdWnt10b处理后28 d,Lef1表达减弱。AdWnt10b处理后2.5 d即可见Ki67表达于表皮和毛囊外根鞘。处理后2.5、7、9、14 d均在隆突区见到Ki67的表达;从处理后7 d开始,Ki67表达于毛母质细胞。 结论 Wnt10b诱导的再生毛囊具有正常的毛囊结构,Wnt10b激活了经典Wnt信号通路,其作用的靶细胞是毛囊干细胞及其子代细胞。     

Wnt信号通路拮抗NDkkl调节骨代谢的最新进展

背景：Dickkopf-1（Dkk1）是一种Wnt信号通路的可溶性胞外抑制剂,可以通过竞争性地结合Wnt蛋白的共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6来阻断经典Wnt/β-catenin途径,进而调控Wnt/β-catenin途径下游靶基因的转录。目的：将Dkk1调节骨代谢的最新进展作一综述,为骨疾病的抗Dkk1治疗提供理论基础。方法：电子检索CBM和Medline数据库中1995至2012年关于Dkk1对骨代谢调节作用的文章,检索词为＂Dkk1;骨重塑;骨疾病＂和＂Dkk1;bone remodeling;bone diseases＂。纳入关于Dkk1调节骨代谢的高质量文献,排除重复发表文献。结果与结论：初始检索118篇文献,按纳入排除标准筛选后,选出36篇文献进行综述。骨组织时刻处于动态的重塑过程中,成骨细胞和破骨细胞的相互作用决定着骨形成和骨吸收之间的平衡。Dkk1可阻断Wnt/β-catenin信号通路、抑制骨形成,同时又通过与骨保护素/核因子ΚB受体活化因子配体/前体细胞表面受体轴的串话作用促进破骨细胞的分化与成熟。促进骨形成、抑制骨吸收是抗Dkk1治疗骨代谢相关疾病引起骨质缺失的主要机制与思路,且临床试验结果良好,Dkk1是一个非常有潜力的骨代谢疾病治疗靶点。     

无翅型MMTV整合位点家族成员3在大鼠牙囊及牙囊细胞成骨分化中的表达

目的 研究无翅型MMTV整合位点家族成员3(wingless-type MMTV integration site family,member 3,Wnt3)在大鼠体内外牙囊中的表达,检测成骨诱导后Wnt3在大鼠牙囊细胞中的表达变化,探讨Wnt3在牙囊成骨分化中的作用.方法 取出生后1、3、5、7、9、11、13 d的SD仔鼠各1只,引颈处死,切取下颌骨,取出生后各时间点的组织切片各3张作为实验组,阴性对照组以磷酸盐缓冲液代替一抗,滴加在出生后11d的组织切片上,其余处理同实验组.免疫组化检测Wnt3在大鼠体内牙囊中的表达.间接免疫荧光检测Wnt3在牙囊细胞内的表达和分布.茜素红染色检测成骨诱导后矿化结节的形成.蛋白质印迹法检测成骨诱导1、2、3周后牙囊细胞中Wnt3和β-联蛋白(β-catenin)表达的变化.结果 Wnt3在出生后第1、3天的大鼠牙囊组织内无明显表达,第5天开始出现阳性表达,并持续表达至第13天.免疫荧光检测显示Wnt3在牙囊细胞胞质中表达.成骨诱导后牙囊细胞分化为成骨细胞,形成矿化结节,茜素红染色阳性.成骨诱导第1周Wnt3蛋白表达(2.60±0.04)较阴性对照组(1.00±0.00)显著增加(P＜0.05),并随着诱导时间的延长Wnt3表达逐渐减少,至第3周Wnt3在成骨诱导组表达水平(1.00±0.05)与阴性对照组基本相等,差异无统计学意义(P＞0.05).β-联蛋白在成骨诱导1、2、3周后表达增加(分别为1.95±0.05、9.77 ±0.65、1.75±0.21),与阴性对照组(1.00 ±0.00)相比差异均有统计学意义(P＜0.05),并在第2周达峰值(9.77±0.65),后逐渐降低.结论 Wnt3在体内外大鼠牙囊中表达,成骨诱导早期牙囊细胞中Wnt3表达明显增加,提示Wnt3可能参与牙囊细胞的早期成骨向分化;Wnt3和β-联蛋白在成骨诱导过程中表达水平的差异提示Wnt3可能与其他因子或信号通路成分相互作用,调控β-联蛋白的表达,参与牙囊细胞的成骨向分化.     

毛乳头诱导毛囊形成和毛发生长信号通路的研究进展

毛乳头是位于毛囊底部的特殊成纤维细胞团块,在毛囊的周期性生长中,毛乳头细胞与周围细胞相互作用而发挥重要功能,被认为是控制毛囊形成和毛发生长信号传导的中心.近年来的研究表明,许多信号通路,包括Wnt、骨形成蛋白、Shh、Notch、成纤维细胞生长因子等信号通路,在毛乳头控制毛囊形成和毛发生长的机制中起作用.可以通过这些信号通路,促进体外培养毛乳头细胞的增殖、加强体外培养毛乳头细胞诱导毛发生长的能力,从而建立一种毛发重构技术用于临床治疗.     

血浆外泌体样小体免疫调节作用的初步研究

目的 鉴定血浆中外泌体(exosomes)样小体,研究其生物学特性及免疫调节作用.方法 利用多次超速离心结合膜超滤的方法,从健康供者血浆中分离纯化外泌体样小囊泡.采用透射电镜从形态学方面鉴定此囊泡为外泌体,用流式细胞术检测其生物学特性.通过磁珠分选从健康供者外周血单个核细胞中分选CD4+T细胞及CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Treg),外泌体样小体与CD4+T细胞或Treg细胞共孵育,通过增殖和凋亡实验分析其免疫调节作用.采用流式细胞术检测外泌体样小体与Treg细胞共孵育后,Treg细胞中Wnt经典信号转导通路中磷酸化β-catenin的变化.结果 人血浆中的外泌体样小体与外泌体在形状和大小方面均相似,表达外泌体的标志性蛋白CD63和CD81,还表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD86等.血浆外泌体样小体与CD4+T细胞孵育后能抑制CD4+T细胞的增殖,且呈剂量依赖性.血浆外泌体样小体与Treg细胞孵育后,Treg细胞的生存时间延长,培养14 d后与血浆外泌体样小体共孵育的Treg细胞存活率为57.07%,而对照Treg细胞存活率为30.91%.RT-PCR检测出Treg细胞有Frizzled受体FRZ2、3、4及LRP6 mRNA表达(相对灰度值分别为48.50、34.84、23.85、49.73),而血浆中外泌体样小体携带Wnt分子.与血浆外泌体孵育后,Treg细胞磷酸化β-catenin平均荧光强度降低(由20.06±2.99降低到12.41±2.08),抗凋亡基因bcl-2明显上调(相对灰度值由0.45上调到84.97).结论 血浆中存在外泌体样小体,表达免疫调节分子,并且体外能够抑制活化的CD4+T细胞增殖,通过Wnt信号转导途径延长Treg细胞生存时间.     

Wnt3a在人骨性关节炎软骨中的表达及相关性研究

目的 Wnt3a参与Wnt经典通路信号的传递,而Wnt通路又参与关节软骨及软骨细胞的发生。本实验目的是检测Wnt3a在骨性关节炎（OA）中的表达及发病风险的相关性。方法 40例人类关节软骨标本,10例正常关节软骨标本（取自外伤、肿瘤截肢术患者）,30例膝OA关节软骨标本（取自膝OA患者）.将取下的软骨标本分为四组：正常关节软骨组、轻度软骨退变组、中度软骨退变组、重度软骨退变组。根据Mankin关节软骨病理评分标准分别打分,按评分结果分组：正常关节软骨标本5份（A组）,OA软骨轻度退变标本6份（B组）,OA软骨中度退变标本13份（C组）,OA软骨重度退变标本16份（D组）。对四组切片行Wnt3a相关染色,根据免疫反应积分IRS打分法进行评分,采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析。统计分析Wnt3a在正常组与非正常组的差异性、表达程度及软骨退变程度的相关性。结果 Wnt3a在三组人膝骨性关节炎软骨呈现一致的高表达,其表达的平均值分别为：3.33±0.516（B组,轻度）,4.85±1.68（C组,中度）,9.44±2.31（D组,重度）。正常组（A组,表达均值和标准差0.0±0.0）与中度、重度退组两两比较,轻度组与中度、重度组,中度与重度组比较显示一致的显著性差异。Wnt3a表达值与其相应的Mankin病理评分呈显著正相关（B组皮尔森相关系数=0.74,P=0.047;C组皮尔森相关系数=0.81,P=0.000 36;D组皮尔森相关系数=0.94,P=2.75e-08）,即关节软骨中Wnt3a的表达与原发性膝骨关节炎（OA）发生与发展程度呈显著的正相关。结论 1在膝骨性关节炎软骨中Wnt3a表达升高;2Wnt3a表达与骨性关节炎关节软骨退变程度呈正相关,可作为OA病程进展的监测指标。     

选择性COX-2抑制剂celecoxib对子宫肌瘤细胞的增殖抑制及其分子机制

目的探讨环氧合酶-2（COX-2）选择性抑制剂塞来昔布（celecoxib）对子宫肌瘤细胞的增殖抑制作用和分子机制。方法给予原代培养的子宫肌瘤细胞不同浓度的celecoxib处理,MTT法测定细胞生长抑制率;半定量RT-PCR法检测子宫肌瘤细胞Wnt信号通路的关键基因Wnt5b、β-catenin、c-myc的表达及塞来昔布对子宫肌瘤细胞增殖活化的影响。结果塞来昔布可显著抑制体外培养的人子宫肌瘤细胞增殖,随着药物剂量的增加和时间的延长,子宫肌瘤细胞的增殖和活化明显抑制,呈剂量和时间依赖性,而这种作用是通过抑制Wnt信号通路实现的。结论子宫肌瘤细胞中存在Wnt信号通路且celecoxib在体外能抑制此通路活化,从而抑制肌瘤细胞的增殖。     

N-cadherin、 β-连环素在肝癌组织中的表达及与Wnt信号途径的关系

目的 观察肝癌(HCC)中N-cadherin分子是否调控β-连环素(β-catenin)的表达及Wnt信号途径的活化。方法 免疫组织化学分析64例肝癌组织中N-cadherin及β-catenin的表达及相互关系。调控肝癌细胞株HCCLM3、SMMC-7721中N-cadherin表达并检测β-catenin的表达及Wnt信号途径的活化。结果 64例肝癌中,N-cadherin表达缺失34例;β-catenin在细胞膜上表达,无细胞核内聚集,且13例细胞膜表达缺失;细胞膜上β-catenin表达缺失与N-cadherin表达缺失呈正相关(P＜0.05)。下调HCCLM3细胞或上调SMMC-7721细胞中的N-cadherin表达导致细胞膜上β-catenin表达减弱或增强,但均未导致Wnt信号途径的活化。结论 在肝癌中,N-cadherin表达与细胞膜上β-catenin的表达水平呈正相关,但N-cadherin分子并不参与Wnt信号途径的调控。     

Wnt5a、MMP2和MMP14在胃癌中的表达及其对临床病理特征的影响

目的研究Wnt5a、MMP2及MMP14在胃癌原发灶中的表达,探讨三者之间的相关性及其与临床病理特征的关系。方法免疫组化染色法检测106例胃癌手术标本及其中的39例正常胃组织中Wnt5a、MMP2和MMP14的表达,2χ检验和非参数检验分析三者间的关系及其与临床病理参数的关系。结果 Wnt5a、MMP2及MMP14在胃癌原发灶中广泛表达,均明显高于正常胃组织中的表达(P0.05)。Wnt5a阳性表达者的肿瘤直径更大、浸润深度更深、区域淋巴结转移程度更高、TNM分期更晚、淋巴结转移率更高、存在淋巴管和血管浸润(P0.05)。MMP2和MMP14阳性表达者的浸润深度更深、区域淋巴结转移程度更高、TNM分期更晚及淋巴结转移率更高(P0.05),且均存在淋巴管浸润(P0.05),但均与血管浸润与否无关。此外,MMP2阳性表达者的肿瘤直径更大(P0.05)。Spearman秩相关分析显示,Wnt5a和MMP2(rs=0.240,P=0.014)、Wnt5a和MMP14(rs=0.251,P=0.010)、MMP2和MMP14(rs=0.444,P=0.000)两两之间表达均存在正相关性。结论 Wnt5a、MMP2及MMP14的表达或能促进胃癌侵袭和转移,且三者之间的表达呈正相关。     

Wnt／β-catenin信号通路参与高渗条件下气道上皮细胞黏液高分泌

目的研究高渗刺激对人气道上皮细胞（16HBE）黏蛋白（MUC）5AC分泌的影响,以及Wnt／β-catenin信号通路可能的介导作用。方法使用浓氯化钠配置高渗培养液,用高渗培养液刺激16HBE细胞,细胞分为常规培养（阴性对照组）以及高渗培养液刺激3、6、9、12h组。ELISA法检测MUC5AC分泌量,Westernblotting法检测人气道Wnt家族蛋白Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt10a、Wnt10b的表达情况。将Wnt4小片段siRNA转染16HBE细胞,再给予高渗培养液刺激。采用ELISA法检测培养上清的MUC5AC分泌量,采用Westernblotting法检测细胞内经典Wnt／β-catenin通路相关信号分子的表达量,细胞免疫荧光法检测核因子（NF）-κBp65核转位情况。结果高渗培养的16HBE细胞上清及胞质中检测到的MUC5AC分泌量显著高于阴性对照组,且MUC5AC分泌量在一定范围内呈时间依赖性（均P〈0．05）。高渗刺激组Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt5a、wnt7a、Wnt10a和Wnt10b表达量较阴性对照组无明显变化（均P〉0．05）,而Wnt4表达量显著升高（P〈0．05）。高渗刺激组细胞内β-catenin和CyelinD1的相对表达量显著高于阴性对照组,细胞免疫荧光法提示NF-κBp65核转位（均P〈0．05）;而经转染Wnt4siRNA后,高渗培养组上清及胞质内MUC5AC分泌量显著低于未转染的高渗培养组（P〈0．05）,细胞内β-catenin、CyclinD1水平及NF-κBp65的核转位现象也受到显著抑制（均P〈0．05）。结论高渗盐水可诱导16HBE细胞MUC5AC高分泌,Wnt／β-catenin信号通路在该效应中有重要的参与作用。