Role of CYP3A in regulating hepatic clearance and hepatotoxicity of triptolide in rat liver microsomes and sandwich-cultured hepatocytes

Triptolide (TP) is an active component of Tripterygium wilfordii Hook. F and widely used to treat autoimmune and inflammatory diseases. It has been demonstrated that cytochrome P450 (CYP) are involved in the metabolism of TP. However, the underlying mechanisms of TP-induced toxicity mediated by hepatic CYP have not been well delineated. In this study, rat liver microsomes (RLM) and sandwich-cultured rat hepatocytes (SCRH) were used to identify the mechanism involving the CYP3A inhibition by TP and to evaluate TP-induced liver damage after CYP3A modulation by the known inhibitor, ketoconazole, and the known inducer, dexamethasone. The results showed that TP itself had a time- and concentration-dependent inhibitory effect on CYP3A. When the CYP3A inhibitor and inducer were added, the enzyme activity and hepatotoxicity changed significantly. The enzyme inducer increased CYP3A activity and decreased the metabolic half life (t_1/2) of TP when compared to the control group, while the enzyme inhibitor had an opposite effect. Our findings reveal that TP is a weak CYP3A inhibitor involving the time-dependent inhibition mechanism. The induction or inhibition of CYP3A played an important role in TP-induced hepatotoxicity. Clinicians should be aware of the metabolic characteristics of TP to maximize therapeutic efficacy and reduce TP-induced toxicity.     

雷公藤内酯醇前药MC002在大鼠体内药代陛别差异研究

目的研究雷公藤内酯醇前药MC002在♀♂大鼠体内代谢是否存在差异。方法两组实验各设♀♂对照。♀♂SD大鼠静脉注射给予MC002 0.75 mg.kg-1,于不同时间点采集全血样品,另♀♂SD大鼠静脉注射给予MC0020.75 mg.kg-1,于5、15、30、90 min后采集各组织样品。样品用乙酸乙酯提取后,LC-MS/MS方法测定,DAS2.0计算药代动力学参数。结果 MC002在♀♂大鼠体内均迅速转化为代谢产物PG490,♀♂大鼠的AUC分别为（8046.2±634.75）和（5604.0±1140.9）μg·min·L-1,CL分别为（0.089±0.01）和（0.128±0.02）L·min-1·kg-1,两组参数统计学上有显著性差异（P〈0.05）,♀♂大鼠组织内浓度变化趋势相同,给药后5 min各组织药物浓度均达到最大值。结论 MC002在大鼠体内迅速转化为活性代谢产物PG490,PG490在大鼠体内代谢呈现出较明显的性别差异,总体表现为♀大鼠血中药物暴露高,代谢慢。♀♂大鼠组织中药物浓度变化趋势无明显差别。     

雷公藤甲素对糖尿病大鼠肾小球内NF-κB、NOS与VEGF表达的影响

目的探讨雷公藤甲素对肾小球内核因子-κB(NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、内皮型一氧化氮合酶(e NOS)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及其对糖尿病大鼠肾小球内皮细胞的保护作用。方法采用链脲佐菌素制作大鼠糖尿病模型,正常对照组、糖尿病对照组及雷公藤甲素治疗组各16只,各组分别于4周、8周处死半数大鼠,测定血糖、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、尿白蛋白(UAE);透射电镜观察肾小球内皮细胞的变化;免疫组化技术检测肾组织中NF-κB、i NOS、e NOS和VEGF,并用Image-pro plus 6.0病理图像分析软件进行半定量分析;实时定量PCR(RT-PCR.)法检测肾组织i NOS、e NOS和VEGF的mRNA表达。结果 1糖尿病组SCr、BUN、UAE较正常组升高,8周时更为明显;与糖尿病组比较,4周时雷公藤甲素治疗组上述指标变化不明显,8周时有明显下降;2糖尿病组肾小球NF-κB、i NOS、e NOS、VEGF表达水平较正常组增加,8周时明显;4周、8周时雷公藤甲素治疗组上述指标均较糖尿病组明显下降;38周时肾小球内NF-κB与i NOS、VEGF与e NOS、NF-κB与VEGF的表达呈正性相关;4透射电镜观察下,三组肾小球内皮细胞结构无明显差异。结论雷公藤甲素可能通过抑制肾小球组织内NF-κB、i NOS、e NOS及VEGF的表达,发挥对糖尿病大鼠肾小球内皮细胞的间接保护作用。     

雷公藤内酯醇对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用研究

目的：研究不同剂量雷公藤内酯醇对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的治疗效果。方法将4只10周龄雄性ApoE-/-小鼠作为模型组,4只10周龄雄性C57BL/6J小鼠作为对照组,适应性喂养1周后处死,取主动脉标本做HE染色。另将10周龄雄性ApoE-/-小鼠32只作为实验组,按每天每千克体重给药量随机分为4组：50μg/（kg·d）、75μg/（kg·d）组、100μg/（kg·d）、空白对照组,每组8只。10周龄雄性C57BL/6J小鼠8只作为阴性对照组。给药3周后处死小鼠,取主动脉标本做HE染色;收集血清,测定IL-10、IL-12含量。结果（1）在11周龄时两组主动脉HE染色Roberts＆amp;Thompson方法评分分别为：模型组[（5.250±0.500）分]＞对照组[（0.500±0.577）分],差异有统计学意义。（2）经不同浓度雷公藤内酯醇处理3周后,各组主动脉HE染色Roberts＆amp;Thompson方法评分分别为：空白对照组[（6.500±0.189）分]＞100μg/（kg·d）组[（4.625±0.183）分]＞50μg/（kg·d）组[（3.375±0.183）分]＞75μg/（kg·d）组[（1.375±0.183）分]＞阴性对照组[（0.000±0.000）分],差异有统计学意义。（3）75μg/（kg·d）组血清中IL-10浓度升高最明显,与各组比较差异均有统计学意义（P＜0.001）;各组血清中IL-12浓度均较空白对照组降低,其中75μg/（kg·d）组降低最明显,两者之间的差异有统计学意义（ P＜0.01）。结论（1）在11周龄时,ApoE-/-小鼠能形成AS模型。（2）不同浓度雷公藤内酯醇处理3周后,ApoE-/-小鼠AS病变有不同程度缓解,其中75μg/（kg·d）浓度下效果最佳。（3）雷公藤内酯醇能够上调IL-10、下调IL-12的表达水平,抑制炎症反应,减轻粥样斑块的形成,此可能为免疫抑制剂抗动脉粥样硬化的机制之一。     

P44/42MAPK介导雷公藤甲素致肾上腺皮质细胞凋亡作用简

目的：了解P44/42丝裂素活化蛋白激酶在雷公藤甲素诱导大鼠肾上腺皮质细胞凋亡中的作用。方法：体外分离培养大鼠肾上腺皮质细胞,以不同浓度梯度雷公藤甲素染毒相同时间,或相同浓度雷公藤甲素染毒不同时间,以蛋白因子添加素V和碘化丙啶联合标记,流式细胞仪检测细胞凋亡率;蛋白印迹法分析P44/42总蛋白量、磷酸化水平以及c-Fos的表达水平。结果：雷公藤甲素以时间和剂量依赖的方式诱导细胞凋亡;雷公藤甲素诱导P44、P42磷酸化水平升高及c-Fos的高表达。结论：一定剂量雷公藤甲素作用于肾上腺皮质细胞后,P44/42过度磷酸化,诱导c-Fos的高表达,导致细胞凋亡。     

雷公藤内酯醇干预高糖诱导足细胞转分化作用机制的研究

目的 观察不同浓度雷公藤内酯醇（TP）体外干预高糖环境下小鼠足细胞上皮细胞向间充质细胞转分化（EMT）及TGF-β/Smad信号通路的调节作用,探讨其保护足细胞损伤的可能机制。方法 将培养成熟的小鼠足细胞随机分为25mmol/L葡萄糖培养液干预组（高糖组）,5mmol/L葡萄糖培养液干预组（对照组）和在25mmol/L葡萄糖培养液中分别加入浓度为8、16、32ng/ml的TP干预组（低、中、高TP组）。体外培养48h后,倒置显微镜下观察足细胞形态变化,采用RT-PCR和Western-blot技术分别检测各组足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的mRNA和蛋白表达变化。结果高糖组和高、中、低TP组的小鼠足细胞NEPH1和Smad7mRNA和蛋白的表达水平均较对照组低,desmin和TGF-β1的mRNA和蛋白的表达水平均较对照组高,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。高、中、低TP组足细胞NEPH1和Smad7的mRNA和蛋白的表达水平均高于高糖组,desmin和TGF-β1的mRNA和蛋白的表达水平均低于高糖组,差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）;中TP组NEPH1和Smad7的mRNA和蛋白的表达水平均高于低TP组和高TP组,desmin和TGF-β1的mRNA和蛋白的表达水平均低于低TP组和高TP组（均P＜0.01）。结论TP可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路缓解高糖诱导的足细胞转分化。     

雷公藤甲素在大鼠体内过程的研究

雷公藤甲素具有抗肿瘤、抗炎和免疫抑制作用,能迅速由胃肠道吸收,但并不完全。本实验研究了该药口服和静注给药途径的分布和排泄,结果表明:口服和静注后,药物在体内的分布和消除速率大体相似,均以肝中浓度为最高,依次为脾、肺、肾、肠、心和脑,体内消除较缓慢。血浆蛋白结合率为64.7%。24d内,口服后尿粪总排泄量为给药量的67.5% ,其中粪占52.4%;静注后为61.9%,粪占25%。24h内胆汁排泄为6.73%。提取尿、粪和胆汁经TLC、放射性测定及放射自显影分析,表明以原药排泄为主和部分代谢物。     

雷公藤内酯醇对小鼠腹腔内激活巨噬细胞杀伤活性和NO分泌影响的实验研究

目的 探讨雷公藤内酯醇(TP)对子宫内膜异位症腹腔大量激活巨噬细胞免疫抑制作用机制,以及其在不同剂量TP和不同时间段杀伤活性和NO分泌的影响。方法 体外培养由脂多糖(LPS)诱导激活的小鼠腹腔巨噬细胞,采用噻唑盐比色(MTT)间接法观察其杀伤活性的变化,并用硝酸还原酶法检测其上清NO的含量变化。结果 TP在1～10μg/ml时对巨噬细胞杀伤活性和NO的产生具有明显抑制作用(P<0.01),且无细胞毒性。TP<1 μg/ml,无统计学意义(P>0.05)。结论 TP能有效抑制小鼠腹腔液中活化巨噬细胞和NO的生成,为临床治疗子宫内膜异位症提供实验依据。     

雷公藤甲素对糖尿病肾病小鼠肾足细胞自噬及调亡的影响

目的:探讨雷公藤甲素对糖尿病肾病(DN)小鼠肾足细胞自噬及调亡的影响。方法:选择小鼠60只,随机分为DN组和雷公藤甲素组各30只,光镜下观察各组肾组织病理学改变情况,观察肾功能变化情况,对其行行威廉姆斯肿瘤蛋白1(WT-1)免疫组化染色,观察足细胞情况,透射电镜观察足细胞自噬情况,采用Western blot法检测肾组织中Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3的表达情况。结果:PAS染色结果显示,DN组小鼠系膜基质明显增多,雷公藤甲素组小鼠系膜基质明显减少。WT-1免疫组织化学染色显示,雷公藤甲素组肾足细胞数量比DN组明显增多。Western Blot结果显示,与DN组小鼠比较,雷公藤甲素组Podocin表达明显增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上升,凋亡相关蛋白Bax及Caspase-3表达明显减少(P 0.05)。结论:雷公藤甲素可减轻足细胞损伤延缓DN的进展,可DN的治疗起到参考价值。     

雷公藤内酯醇(T10)通过抑制脊髓背角内p38-MAPK的磷酸化发挥镇痛作用的机制研究

目的:观察鞘内给予雷公藤内酯(triptolide,T10)对于慢性炎性痛和神经病理性痛模型大鼠脊髓背角小胶质细胞内p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化水平的影响。方法:采用大鼠足底注射完全弗式佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)构建慢性炎性痛模型,L5脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)和坐骨神经分支选择性结扎(spared nerve injury,SNI)的方法制作慢性神经病理性痛模型。利用von Frey丝刺激法连续观察造模后大鼠的痛行为变化;应用免疫荧光染色方法观察大鼠腰膨大节段胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和电离钙绑定衔接分子1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)的表达水平;应用Western Blot方法观察大鼠腰膨大节段p38 MAPK的磷酸化水平。结果:(1)行为学结果显示:CFA、SNL、SNI模型大鼠机械性痛阈均明显降低,且术后一周内与正常对照组相比均保持在较低水平(P0.01)。从术后第1 d起鞘内连续给予T10至第7 d,分别观察到T10能够明显提高上述模型大鼠手术侧后足的机械性痛阈(P0.05);但T10在SNL模型和SNI模型大鼠中的效果要弱于CFA引起的慢性炎性痛(P0.05)。(2)免疫荧光染色结果显示:CFA、SNL和SNI模型大鼠腰膨大脊髓背角内GFAP、Iba-1的表达明显高于正常对照组,而p-p38 MAPK阳性产物主要表达于小胶质细胞内。(3)Western Blot结果显示:造模后7 d脊髓背角内p-p38 MAPK的表达明显上调,鞘内给予T10后可以显著下调脊髓背角内p38的磷酸化水平(P0.05)。结论:鞘内给予T10有效缓解由于CFA、SNL和SNI诱导的慢性痛模型大鼠的机械性痛阈的机制可能是通过下调脊髓背角内p38 MAPK信号通路的磷酸化水平,进而达到抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。其次,T10对不同类型的疼痛模型的作用效果存在差异,对由CFA引起的慢性炎性痛的作用效果要强于由SNL和SNI诱导的慢性神经病理性痛。