RNA干扰及其在哺乳动物基因功能研究中的应用

RNA干扰是由与靶基因序列同源的小的双链 RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象。它能特异性地抑制某些基因的表达。小于 30 nt的小双链 RNA是哺乳动物 RNA干扰现象的中介因子。随着对 RNA干扰发生机制的深入研究 ,它作为一项遗传学技术已被应用于哺乳动物基因及蛋白质功能的研究 ,并在基因治疗中显示出巨大的潜力。得益于载体导入系统的发展 ,这项技术将有广阔的应用前景。     

靶向血管内皮生长因子C短发夹式RNA对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响

目的 研究重组质粒表达载体介导的短发夹式RNA(shRNA)对乳腺癌MCF-7细胞株中血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达及乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 脂质体介导重组质粒pSIREN-VEGF-C转染乳腺癌MCF-7细胞株,嘌呤酶素筛选阳性克隆;荧光定量PCR及Western blot检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C基因的表达;MTT法及Transwell体外侵袭实验检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞的增殖及侵袭能力.结果 转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P<0.05);MTT法和 Transwell体外侵袭实验显示,与阴性质粒组和空白对照组比较,转染重组质粒后各时间段乳腺癌MCF-7细胞增殖均明显受抑制(P<0.05),同时穿膜的肿瘤细胞数也明显减少[(29.0±1.9)个与(59.0±2.1)个和(61.0±2.2)个相比,P<0.05].结论 表达VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C在乳腺癌MCF-7细胞中能高效、特异地发挥靶基因沉默作用,并对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力有显著抑制作用.     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

52 例病毒性肝炎患者肝组织中丙型肝炎病毒 RNA 和 HCAg-NS3 的测定

应用地高辛标记探针原位杂交法和单克隆抗ＨＣＶ－ＮＳ３－ＨＲＰ建立直接酶标免疫组化法分别测定５２例肝炎患者肝组织ＨＣＶＲＮＡ和ＨＣＡｇ－ＮＳ３。结果抗ＨＣＶ阳性组ＨＣＶＲＮＡ检出率５７．１％（１６／２８），ＨＣＡｇ－ＮＳ３检出率５３．６％（１５／２８）；抗ＨＣＶ阴性组其两项检出率均为１２．５％（３／２４）。肝组织中ＨＣＶＲＮＡ阳性物呈蓝紫色细小颗粒存在于肝细胞核或胞浆内，其在肝小叶中的分布可分为３型，即弥漫型、局灶型、散在型。肝组织中ＨＣＡｇ－ＮＳ３阳性物呈棕黄色细小颗粒分布于肝细胞核或胞浆内，以单个或数个阳性细胞散布于肝小叶中。２３例ＨＣＶＲＮＡ或／和ＨＣＡｇ－ＮＳ３阳性病例以肝炎后肝硬化（ＬＣ）病例占多数（１４／２３），其次为慢性重型肝炎（ＣＳＨ）和中度慢性肝炎（ＣＡＨ）。此两种检测方法具有较高符合率（９０．４％，４７／５２），表明病毒核酸及其表达产物均存在于肝细胞内，与ＨＣＶ感染密切相关。这为ＨＣＶ感染诊断提供了直接依据，有利于研究ＨＣＶ感染中病毒复制、慢性化进程、抗病毒治疗监测及重叠感染时病毒相互关系。     

强光干扰下的眩光评价研究

眩光是影响视觉的一个重要因素，而眩光后人眼的恢复时间则是进行眩光评价的重要标准。目前的眩光研究都是停留在针对普通照度的眩光源的研究背景下。通过对能产生高照度的眩光源照射后的人眼视觉恢复情况的实验研究，得到在强光干扰条件下的眩光影响因素关系。根据实验数据进行人眼恢复时间计算公式的修正，提出一种在强光干扰下对眩光的客观评价方法。通过实验，基本验证了该公式在高照度情况下的有效性和客观性。     

survivin的siRNA靶向干扰膀胱癌的实验研究

目的实验研究靶向转染survivin的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对膀胱癌生物学行为的影响。方法设计1对survivin编码基因序列特异的siRNA，用脂质体转染T24膀胱癌细胞株。采用流式细胞术检测转染效率和细胞凋亡；荧光实时定量PCR检测干扰前后survivin的mRNA表达；用survivin的siRNA片段插入空载体后建立重组载体pRNAT-U6、1／Neo-survivin。结果脂质体转染T24细胞后的转染效率为92．3％；survivin编码基因序列特异的siRNA能有效下调survivin基因的表达，呈时间和剂量依赖性，最大效应浓度为100nmol／L，此时survivin表达水平下调了75．91％，并显著地抑制了细胞生长，抑制率达55．29％，差异有统计学意义（P〈0．01）；细胞凋亡率亦增至45．70％，与对照相比差异有统计学意义（P〈0．01）。用限制性内切酶将空载体线性化，T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中，对该重组表达载体进行鉴定，获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-survivin。结论siRNA．survivin能显著下调膀胱癌细胞survivin基因表达水平，促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，可能成为膀胱癌基因治疗的新工具。成功构建的靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体为进一步应用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

核Run—off转录活性测定

本文介绍一种在真核基因转录调控研究中,十分重要的检测技术——核Run-off转录活性的分析,并详细叙述了操作的具体步骤,特别强调了因各实验室选择样品材料的不同,需首先确定核转录的最适条件,如核染色体DNA模板数量,掺入同位素量和反应最适时间等,以便能成功地应用此项技术。     

异种VEGF融合蛋白疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

目的:利用原核表达系统,构建异源血管内皮生长因子融合蛋白疫苗,研究该融合蛋白疫苗对小鼠Lewis肺癌肿瘤模型的抗血管生成主动免疫治疗效果.方法:将鸡VEGF基因克隆入pGEX-4T-2原核表达载体,经IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-NTA纯化,透析复性,构建GST-cVEGF融合蛋白疫苗.将C57BL16J小鼠随机分为3组,GST-cVEGF疫苗组10只、cVEGF疫苗组10只、生理盐水组(NS) 10只.将各组样品与等体积弗氏佐剂混合,各组小鼠每只分别0、2、3周免疫100 μg GST-cVEGF融合蛋白疫苗、单纯cVEGF蛋白疫苗、生理盐水.接种Lewis肺癌细胞,观察肿瘤的生长情况和小鼠状态.接种肿瘤18 d后,处死小鼠,剥离肿瘤称重.检测小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度.结果:GST-cVEGF疫苗组、cVEGF组、生理盐水组肿瘤均重分别为(1.55±0.534) g、(1.93±0.607) g、(2.87±0.642) g.GST-cVEGF疫苗组肿瘤重量明显小于生理盐水组(P<0.01).疫苗组血清产生抗VEGF抗体滴度为1:2000.结论:异种血管内皮生长因子基因重组融合蛋白疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受,可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体,并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应.     

汉坦病毒A9株全长L片段cDNA克隆和核苷酸序列测定

目的克隆我国分离的汉坦病毒A9株L片段全长cDNA,并测定其核苷酸序列.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分段扩增汉坦病毒A9株全部L片段,用T-A克隆方法进行PCR产物克隆,测定PCR产物的核苷酸序列.通过亚克隆将分段的L片段连接成全长cDNA克隆.结果A9株的基因组L片段长度为6533个核苷酸,腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(%A+U=62.47).包含有一个单一的开放读码框架(ORF),编码一个标准的质量为2.46×105的蛋白,含有2151个氨基酸.A9株与76-118、C1-1和C1-2株的同源性最高,达到83.8%.与TULA病毒的关系较远,其核酸序列的同源性为65.8%.将推导的A9株编码的氨基酸序列与其他21种负链RNA病毒的依赖RNA的RNA聚合酶的氨基酸序列以及汉坦病毒几个代表株的L片段氨基酸序列进行比较,显示A9编码的RNA聚合酶也有6个比较保守的区域以及几个极端保守的氨基酸残基.结论汉坦病毒A9株L片段具有和其他汉坦病毒RNA聚合酶相似的核苷酸一级结构,通过对推导的氨基酸分析,该片段具有一些在RNA病毒聚合酶中都存在的保守区域.