丙型肝炎病毒基因分型及其与干扰素治疗应答的关系

目的为了解山西省丙型肝炎病毒的基因型和基因型对干扰素疗效的预示价值。方法用ＨＣＶ５’ＮＣ区酶切分型方法对９４例丙型肝炎病人进行基因分型，并观察其中４５例患者对干扰素α１ｂ治疗的应答。结果显示ＨＣＶⅠ组（Ⅰ、Ⅱ型）感染８０例（８５１％），ＨＣＶⅡ组（Ⅲ、Ⅳ型）感染１２例（１２８％），ＨＣＶⅠ／Ⅱ组混合感染２例（２１％）。在接受干扰素治疗的病例中，ＨＣＶⅠ组感染（３５例）的应答率为３７１％，持续应答率为１７１％，而Ⅱ组感染（１０例）的应答率为８０％，持续应答率为６０％，两组相比，有显著性差异（Ｐ＜００５，Ｐ＜００２５）。结论表明山西省以ＨＣＶⅠ组感染为主，干扰素对ＨＣＶⅡ组感染的疗效优于ＨＣＶⅠ组感染，ＨＣＶ基因型有预测干扰素疗效的意义。     

逆转录病毒载体介导的HBsAg抗原表达及其稳定性研究

目的 探讨逆转录病毒载体介导的HBsAg抗原的表达及其稳定性。方法 将HBsAg基因插入逆转录病毒载体PLXSN中，构建成重组逆转录病毒载体。用电穿孔法转染PA317细胞，包装成假病毒颗粒，在不同温度下冻存。于不同时间用假病毒颗粒感染HepG2、NIH3T3及293细胞，用RT—PCR及ELISA法检测HBsAg表达；以感染后G418抗性克隆形成数确定假病毒颗粒的活力。结果 在各个时间段HBsAg表达量均差异无显著性。在-20℃冻存时，6个月后克隆数即下降过半，12个月后仅形成少数克隆，24个月后无克隆形成；在-40℃冻存时12个月后HepG2、NIH3T3、293形成的克隆数分别为121、332和89，24个月后分别为42、137和43，与冻存前比较差异有显著性；-70℃冻存时，24个月后克隆数分别为159、463和112，与冻存前比较差异无显著性。结论 HBsAg重组逆转录病毒颗粒在-70℃保存2年后，病毒活力未受明显影响，HBsAg表达量亦无明显改变。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2细胞中的表达及其对端粒酶活性的影响

目的 建立HCV核心蛋白细胞表达模型，并探讨其对细胞端粒酶活性的影响。方法 用PCR法扩增出HCV核心基因cDNA，将其插入真核表达载体pBK-CMV的HindⅢ和BamHⅠ位点间，构建重组质粒pBK-HCVc。再将重组质粒pBK-HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT－PCR、免疫组化和蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。PCR－ELISA法检测端粒酶活性。结果 构建的pBK-HCVc质粒在HepG2细胞中有稳定表达。表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的端粒酶活性较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显升高。结论 HCV核心蛋白上调了端粒酶活性，可能是HCV诱发肝细胞癌的一种途径。     

一个能诱生戊型肝炎病毒中和抗体的ORF2编码蛋白短片段

目的：比较戊型肝炎病毒（HEV）第4基因型ORF2编码蛋白片段pN472-C617（aa472～617）和pN477-C613（aa477～613）的免疫原性，找到能诱生HEV中和抗体的ORF2编码蛋白的更短片段。方法：表达和纯化pN472-C617和pN477-C613，分别免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA检测免疫血清的抗体效价，并以基于PCR的体外中和试验检测免疫血清的中和活性。结果：pN472-C617和pN477-C613可在大肠杆菌高效可溶性表达，纯化后的重组蛋白能在小鼠体内诱导出高效价的抗体。基于PCR的体外中和试验显示pN472-C617免疫血清可有效中和HEV，阻断其在敏感细胞表面的吸附和细胞内复制；而两端仅比pN472-C617各短5个氨基酸的pN477-C613的免疫血清不具有中和HEV的活性。结论：重组蛋白pN472-C617具有良好的抗原性和诱生中和抗体的能力，是目前文献报道中含有HEV中和抗原表位的最短ORF2编码蛋白片段，可作为重组亚单位候选疫苗用于HEV疫苗的开发。     

慢性乙肝患者血清趋化因子RANTES水平与肝功能生化指标等的相关性研究

Objective To investigate the level of the serum chemokine RANTES and its correlation with serum biochemical indices of liver function test, HBeAg and HBV DNA load in patients with chronic hepatitis B.Methods 144 patients with chronic hepatitis B (observed group) and 18 normal cases (control group) were enrolled in this study. The serum level of chemokine RANTES was detected with an ABC-ELISA assay. Statistical analysis was performed on the software of SPSS13.0. Results The serum chemokine RANTES level in the observed group (3930.12 ng/ml±2856.96) ng/ml was significantly higher than that in the control group (329.46 ng/ml±152.23) ng/ml. The results from the observed group indicated the positive correlation of serum RANTES level with indices of liver function test, including ALT (r=0. 197, P=0.018), AST(r=0.239, P=0.004) and TBil (r=0.316, P=0.001), but did not with PTA (r=-0.078, P=0.357). Neither difference of serum chemokine RANTES level between HBeAg-positive group and HBeAg-negative group nor that between high HBV DNA load group (≥105 copies/ml) and low HBV DNA load group (< 105 copies/ml) were statistically significant (P=0.407 and 0.185, respectively). Conclusions Serum chemokine RANTES level in patients with chronic hepatitis B elevates significantly and is not affected by HBeAg or HBV DNA load. Its positive correlation with indices of liver function test indicates that RANTES might play an important rule in the pathogenesis of chronic hepatitis B.     

血清乙型肝炎病毒DNA水平对HBV全基因组克隆效率的影响

目的：通过比较血清HBV DNA水平对一片段PCR法和两片段PCR法这两种不同方法的HBV全基因组克隆效率的影响，选择出合适的HBV全基因组克隆技术，供后续的HBV的基础和临床研究。 方法：采集了慢性乙型肝炎（CHB）患者85份血清，分别用本研究建立的一片段PCR法及两片段PCR法扩增HBV全基因组，经双酶切鉴定后将PCR产物克隆入载体，进行HBV全基因组序列测定。同时用实时荧光定量PCR法检测上述85份血清的HBV DNA滴度。 结果： 本研究建立的一片段PCR法扩增成功需要的血清HBV DNA浓度高于两片段PCR法,两种方法扩增的效率比较为：一片段PCR法扩增的阳性率低于两片段PCR法（P<0.01）。一片段PCR法的保真性和灵敏度分析发现： 保真性：核苷酸的人为突变率为1.13 bp/kb；灵敏度：为102个初始模板。浓度大于103的重组质粒DNA80%可以成功扩增，浓度低于该值的扩增效率比较低。结论： 血清HBV DNA水平对两种扩增方法的阳性率有一定影响，滴度高低是选择合适PCR扩增方法的依据。HBV DNA滴度大于106copies/L的样本，可选用一片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术，而对HBV DNA滴度小于106copies/L样本，则可选用两片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术。本研究建立的一片段PCR法扩增HBV全基因组克隆的技术是一种值得推荐的好方法，但还需进一步优化。     

戊型肝炎病毒Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ基因型B细胞抗原表位的异同

目的：制备戊型肝炎病毒(HEV)缅甸株和墨西哥株ORF2重组蛋白(p166Bur和p166Mex)的单克隆抗体(McAbs)，用于分析HEV不同基因型B细胞抗原表位的特点。方法：将免疫BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，获得分泌抗-p166Bur和抗-p166Mex McAbs的杂交瘤细胞株，然后采用ELISA和免疫印迹法测定McAbs与不同基因型HEV ORF2编码蛋白p166的免疫反应性。结果：获得4株杂交瘤细胞株，即分泌抗-p166Bur McAbs的2G2、2B1以及分泌抗-p166Mex McAbs的D8G10和E5E12，其中2B1分泌的McAb仅能与第Ⅰ、Ⅱ基因型编码的重组蛋白结合，而其余3株分泌的McAbs既能与Ⅰ、Ⅱ基因型HEV的p166重组蛋白发生反应，也能与Ⅲ、Ⅳ基因型的p166蛋白反应。结论：HEV第Ⅰ、Ⅱ基因型与Ⅲ、Ⅳ基因型ORF2编码蛋白既有共同又有不同的B细胞抗原表位。     

不同方法注射乙肝免疫球蛋白阻断HBsAg、HBeAg双阳性孕妇母婴传播的研究

目的研究不同方法注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)对HBsAg伴HBeAg双阳性孕妇的乙肝病毒(HBV)宫内感染阻断作用。方法将137例双阳性孕妇分为4组:A组从孕16周起注射HBIG,B组从孕20周起注射HBIG,C组从孕28周起注射HBIG,A、B、C 3组孕妇每次均注射HBIG200IU,并间隔4周1次,直至临产;D组作为对照组,不注射HBIG;出生后4组所有新生儿均于16h内和生后2周注射HBIG200IU,满月起按1、2、7月龄分别接种乙肝疫苗,并定期随访。结果新生儿出生时外周血测得HBsAg,A组与B组无显著性差别(P>0.05),A、B 2组与C组、D组以及C组与D组均有显著性差别(P均<0.05);经随访A、B、C、D 4组HBV宫内感染率分别为5.6%、5.3%、19.4%和48.5%,母婴传播阻断率A组与B组无显著差异(P>0.05),A组和B组均显著高于C组和D组、C组显著高于D组(P均<0.05)。结论对HBsAg伴HBeAg双阳性孕妇,选择孕20周开始注射HBIG比较合适,阻断率最高,能有效减少HBV宫内感染的发生率。     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

Prevalence of hepatitis B virus infection among women at reproductive age at a German university hospital

BACKGROUND: Mother to infant transmission of hepatitis B virus (HBV) represents a major factor in maintaining chronic infection and depends on the degree of maternal infectivity status. OBJECTIVES: To examine the seroprevalence of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) in women at reproductive age admitted to the Department of Gynaecology at a German university hospital. STUDY DESIGN: The seroprevalence of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in 5518 women at reproductive age was examined, HBsAg-positive samples were tested for additional HBV markers to verify the infection status. RESULTS: Out of 5518 samples from women at reproductive age, 88 women (1.59%) were positive for HBsAg and 7 of these HBV-positive women (7.95%) were additionally positive for HBeAg. The majority of the study population were German citizens, however most HBV infected persons originated from countries with a high HBV prevalence. The HBV seroprevalence in our study group is about two times higher compared to the average seroprevalence in the German citizen adult population, thus probably resulting in an underestimation of the infection rate in a multinational setting. CONCLUSIONS: Screening for HBsAg during pregnancy is still necessary and important for reduction of perinatal HBV transmission even in countries with low HBV prevalence.