H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1血凝素基因裂解位点突变中的应用

目的基于焦磷酸测序技术建立甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因裂解位点突变的快速检测方法,探讨其临床应用价值。方法采用RT-PCR扩增甲型H1N1病毒血凝素基因中的HA片段,在生物信息学分析的基础上,针对甲型H1N1病毒血凝素基因含有裂解位点序列片段,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含甲型H1N1病毒裂解位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的裂解位点基因特征。结果建立了基于焦磷酸测序技术检测甲型H1N1流感病毒裂解位点突变方法,实现甲型H1N1流感病毒HA基因裂解位点的高通量检测,青岛地区甲型H1N1流感病毒裂解位点344氨基酸序列没有发生变异。结论本研究所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于甲型H1N1流感病毒裂解位点进行快速高通量检测。     

甲型流感病毒宿主特异性研究进展

大量证据显示，哺乳动物甲型流感病毒可能来源于野生水禽。甲型流感病毒由水禽传播给家禽和哺乳动物是近年流感爆发的根源；但不同物种来源的甲型流感病毒不能在其他物种中有效繁殖，表明甲型流感病毒存在宿主特异性。本文简要概述了近年来流感病毒宿主特异性的相关知识及研究进展，重点介绍宿主受体唾液酸衍生物种类、唾液酸一半乳糖基连接键型对病毒感染宿主特异性的影响以及流感病毒血凝素的受体特异性。     

上海地区2004-2008年流行性感冒病毒亚型分布及血凝素基因进化研究

目的 了解上海地区近几年的流行性感冒(简称流感)病毒型与亚型分布及甲亚型流感病毒血凝素(HA)基因的进化.方法 采集2004-2008年上海地区5个流感监测哨点流感样患者和聚集性流感暴发患者的962份咽拭子标本进行流感病毒分离鉴定,确定病毒型及亚型.对上海市不同年份、不同区域的甲型流感病毒散发、聚集性暴发分离株进行HA基因全片段测序,并与近几年世界卫生组织(WHO)疫苗推荐株进行比对分析,绘制基因进化树.结果 A/H3N2是近几年季节性流感的主要亚型,占阳性标本构成比为54.9%(162/295),但在2005年末至2006年夏季流行强度低,仅占阳性标本构成比分别为0%(0/16)和23.5%(8/34);A/H1N1在2005-2006年3个流行季节活跃,占阳性标本构成比分别达到21.4%(12/56)、43.8%(7/16)、76.5%(26/34),近2年分离株明显减少,占阳性标本构成比仅分别为0%(0/44)和5.0%(7/139);B型在2004年至2005年季节性流感中活动强度较高,占阳性标本构成比分别为42.9%(24/56)和56.2%(9/16),在2006-2007年季节性流感中未分离到,2008年流行强度又有增加,占阳性标本构成比为34.5%(48/139).2005-2008年,A/H1N1 HA基因进化树显示,同一年份HA基因成簇分布,序列相近;2004-2008年,A/H3N2 HA基因进化树显示,虽然同一年份序列相近,但相近序列进化枝插有相近年份的分离株,并且同一年份存有变异较大的序列.A/H1N1、A/H3N2流行株的序列与当年WHO的疫苗推荐株序列相似.结论 各年份流感流行的型与亚型分布不同,A/H3N2是近几年季节性流感的主要亚型.同一年份的A/H1N1、A/H3N2 HA基因序列成簇分布,但在A/H3N2同一年份的进化枝中插有相近年份的分离株序列,并且存在变异较大的序列.近年,WHO疫苗推荐株HA序列与当年流行株序列相近.     

表达甲型H1N1流感病毒血凝素抗原的DNA疫苗构建及其免疫原性评价

目的 构建表达甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)抗原的DNA疫苗,并在小鼠中测试其免疫原性.方法 运用人密码子优化技术合成甲型H1N1流感病毒HA序列,并转移至DNA疫苗载体,用Western blotting检测其表达效率.采用单纯随机抽样方法把BALB/c小鼠分成DNA疫苗组和对照组.用...     

流感病毒裂解疫苗的稳定性观察

目的 观察国产流感病毒裂解疫苗（流感疫苗）的稳定性。方法 取58批上海生物制品研究所有限责任公司（上海公司）2011－2018年生产的流感疫苗,按照国家食品药品监督管理总局批准的流感疫苗注册标准和中国药典的要求进行各项检定,在0月和12个月做全项检定,在3、6、9个月进行血凝素含量检测。结果 流感疫苗在有效期内各项指标检定结果均符合注册标准和药典要求。各型流感病毒株血凝素含量均为配制量的80%~120%。结论 上海公司生产的流感疫苗质量稳定。     

2009年山东省四起甲型H1N1流行性感冒样病例暴发疫情病原学分析

目的 通过对2009年山东省济宁市4起流行性感冒(简称流感)样病例暴发疫情进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况.方法 采集4起流感样病例暴发疫情中发热患者的鼻咽拭子标本34份,采用逆转录实时PCR(realtime RT-PCR)方法进行核酸检测,对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序.利用DNAStar软件对序列进行同源性分析,利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析.与WHO推荐的疫苗株及国内代表株进行对比.结果 在34份鼻咽拭子标本中,17份甲型H1N1流感病毒阳性,11份标本分离培养出了甲型H1N1流感病毒.将其中的7株进行HA基因和NA基因测序,HA、NA基因的同源性分别为98.4%～99.6%、99.2%～100.0%.与WHO推荐的疫苗株及国内代表株相比,有11个HA基因的氨基酸发生替换,分别为38、40、56、90、100、145、172、173、220、303及338位,其中38、40和303位位于抗原决定簇C区,172和173位位于抗原决定簇D区,56位位于抗原决定簇E区,同时40位为糖基化位点;有7个NA基因的氨基酸发生了替换,为80、106、241、248、351、369和386位,386位为糖基化位点;未发生神经氨酸酶蛋白275位H-Y的替换.结论 山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变.     

表达甲型H5N1禽流感病毒结构蛋白的重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的  构建表达甲型H5N1禽流感病毒（H5N1 avian influenza A virus,H5N1 AIAV）NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒,为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法  通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）编码基因,并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒 pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan,VTT）于Vero细胞中发生同源重组后,筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒（rVTT-HA/NA）,并对其进行鉴定。结果  反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp,与预期相同。DNA测序证实,改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明,HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示,rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性,血凝滴度为1∶32。结论  重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。