禽流感 HA 基因密码子优化的 DNA 疫苗构建及其免疫原性的初步研究

 目的 构建H5 N1亚型禽流感病毒株密码子优化的血凝素（HA）DNA疫苗并研究其免疫原性。方法 应用MacVector软件分析H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam 1203/04株HA（H5-VN HA）基因序列，对这些序列进行密码子优化处理，人工合成优化后的H5-VN HA基因。将密码子优化H5-VN HA基因与pSW3891质粒连接，并以人组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）信号肽取代H5-VN HA信号肽，构建成表达H5-VN HA基因的重组质粒，命名为HA-VN.tPA（即密码子优化的H5-VN HA基因DNA疫苗）。以HA-VN.tPA转染293T细胞，应用蛋白质印迹法检测转染细胞中HA蛋白的表达。以HA-VN.tPA对2只新西兰兔进行DNA免疫，用ELISA方法检测分析免疫后兔血清中HA特异性抗体的产生。结果 密码子优化的H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因。蛋白质印迹法分析结果表明，HA-VN.tPA转染293T细胞后，细胞裂解液中检测出HA蛋白的表达。ELISA分析结果表明，以HA-VN.tPA免疫3次后，实验兔体内产生了较高水平的HA特异性抗体（血清中平台期抗体滴度达1:13 500）。结论 成功构建了H5N1亚型禽流感病毒密码子优化的HA 基因DNA疫苗，该疫苗可引导免疫后宿主体内产生高滴度特异性抗体。     

类风湿关节炎患者外周血T细胞抑制性多肽的研究

目的探讨HLADRB1结合性流感病毒血凝素(HA)308317变构肽对类风湿关节炎(RA)患者外周血T细胞激活的影响。方法选取27例HLADRB1阳性的RA患者,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。采用固相法合成HA308317变构肽,并检测RA患者外周血T细胞对这些多肽的反应性;及多肽对白细胞介素(IL)2、γ干扰素分泌及CD69表达的影响。同时进一步观察HA308317变构肽对CII263272或HA308317多肽介导的T细胞激活的抑制作用。结果变构肽刺激T细胞增殖的阳性率分别为7.4%(APL1)、3.7%(APL2)和3.7%(APL3),明显低于CII263272和HA308317原型肰(62.2%和52.9%),3条变构肽的刺激指数也明显低于原型肽(均P<0.01)。并且,其诱导IL2、γ干扰素分泌的水平及CD69的表达亦下降(P<0.05)。与单独加入CII263272或HA308317原型肽的对照组相比,加入HA308317变构肽的T细胞增殖的刺激指数明显下降(P<0.05)。结论替换HA308317多肽中T细胞受体的接触残基产生了弱或非T细胞刺激肽,它们可能有效地抑制RA的T细胞免疫反应。     

禽流感病毒感染小鼠前后表面蛋白编码基因变异情况分析

目的了解禽流感病毒（AIV）在感染小鼠前后表面蛋白编码基因的特点及变异情况。方法在A／Goose／Guangdong／NH／2003（H5N1）感染小鼠肺组织的第12小时和第9天各分离1株AIV病毒，通过鸡胚增殖后提取RNA，反转录合成cDNA，经PCR扩增和产物纯化构建重组质粒，用双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定并进行基因特性分析。结果3株病毒HA基因的核苷酸序列同源性为99．6％～99．8％，推导氨基酸序列的同源性为99．3％～99．6％。3株病毒NA基因的核苷酸序列同源性为99．8％-99．9％，均为同义突变。M基因未发生任何变异。结论AIV感染小鼠后HA基因出现变异，NA和肘基因未出现有意义的突变。     

新近分离的甲型流感病毒（H1N1）血凝素氨基酸序列分析

2009年3月,墨西哥暴发甲型H1N1流感,随后疫情迅速蔓延。截至2009年6月5日,全球已有69个国家出现甲型H1N1流感确诊病例,共确诊21940例,死亡125例。我国确诊107例,内地61例,中国香港30例,中国台湾16例。4月30日,我国卫生部将甲型H1N1流感纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病,并采取甲类传染病的预防、控制措施,同时还将其纳入了《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。导致此次流感暴发的H1N1型流感病毒是变异后的新型病毒,为加深大家对此类病毒的认识,切实做好疫情的防控工作,本刊特组织了一系列甲型H1N1流感相关文章、指南和方案,供大家参考。     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2基因缺陷型突变株的构建

目的 构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)血凝素2(hemagglutinin-adhesin 2,HA-2)基因缺陷型突变株,为研究HA-2基因功能奠定基础.方法 PCR扩增PgHA-2基因两翼片段HA_u、HA_1,将抗性基因ermF-ermAM连接到两者之间构建打靶载体HA-ermF-ermAM.将HA-ermF-ermAM电转化PgATCC33277,基因同源重组整合进入PgATCC33277染色体,用选择性培养基筛选获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.进行PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与其野生株凝血功能试验,比较二者的凝血功能差异.结果 PCR、酶切和测序鉴定结果表明,打靶载体HA-ermF-ermAM成功构建.经PCR鉴定,打靶载体HA-ermF-ermAM通过同源重组整合进入PgATCC33277染色体,成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.凝血实验结果表明,PsATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与野生株相比凝血能力明显减弱.结论 成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株,为进一步研究HA-2的生物学性质奠定了基础.     

北京地区2009-2010年流感监测季乙型流感病毒HA基因特征分析

目的了解2010年1~4月间北京地区流感病原学监测中分离到的乙型流感病毒株血凝素(HA)基因的特征,探讨2009-2010年流感监测季乙型流感病毒的分子流行病学特征。方法采用一步法RT-PCR方法,随机抽取32株本监测季分离到的乙型流感病毒毒株进行血凝素基因的扩增,将扩增产物进行序列测定,采用相应的生物信息软件进行核酸及氨基酸序列比对以及进化树分析。结果 2009-2010年流感监测季期间,北京地区人群中乙型流感病毒以Victoria系的活动占优势,其间分离的32株病毒的HA基因与2009-2011年北半球的疫苗株B/Brisbane/60/2008相比,31株在HA1区发生I73P的变化,32株发生I161V的变化,氨基酸的替换均发生在抗原决定簇A区。绘制的种系发生树显示这些毒株与B/Brisbane/60/2008亲缘关系最近,而与B/Malaysia/2506/2004以及B/Hong Kong/330/2001差异较大。结论 2010年1~4月间北京地区人群中Victoria系乙型流感病毒的HA基因发生变化,导致其抗原性发生改变,表明北京地区人群中流行的乙型流感病毒的抗原性和基因特性在逐渐发生变异,今...     

甲型H1N1流感死亡病例三株病毒分离株血凝素基因测序分析

目的 对长沙市3株甲型H1N1流感死亡病例病毒分离株HA基因的来源和变异情况进行研究.方法 对长沙市的3例甲型H1N1流感死亡病例的鼻/咽拭子标本进行RT-PCR检测和流感病毒分离,利用WHO推荐的测序引物和CEQTM8000 Genetic Analysis System对3株甲型H1N1流感死亡病例病毒株[A/湖南开福/SWL4142/2009(H1N1),A/湖南长沙/SWL4346/2009(H1 N1),A/湖南芙蓉/SWL4224/2009(H1N1)]HA基因进行测序,测序方法为末端标记循环法(Dye Terminator Cycle sequencing),测序结果提交至GenBank,并用ClustalX和Mega4.1软件对测序结果进行氨基酸比对分析和构建进化树.结果 A/湖南开福/SWL4142/2009(H1N1),A/湖南长沙/SWL4346/2009(H1N1)和A/湖南芙蓉/SWL4224/2009(H1N1)3株病毒株HA基因序列分别与甲型H1 N1流感病毒A/NewYork/3502/2009(H1N1),A/Shanghai/71T/2009(H1N1)和A/Chita/01/2009(H1N1)分离株高度同源,同源性为99%,与国内甲型H1N1流感病毒株A/Sichuan/1/2009(H1N1)核苷酸同源性在99.5%以上;进化树分析显示包括3株病毒株在内的甲型H1N1流感病毒与A/Swine/Indiana/P12439/00亲缘关系近,但与人季节性A流感病毒(H1N1)、禽流感亲缘关系较远.与A/Swine/Indiana/P12439/00 HA基因比较发现:3株病毒株HA基因分别有28、30、27个氨基酸发生变异,但3株病毒株在21个重要抗原位点中只有一个R53K氨基酸替换;对全球364条甲型H1N1流感病毒HA基因序列进行多重比对发现有119个非保守氨基酸位点,其中5个位于重要抗原位点.结论 3株病毒株和其他甲型H1N1流感病毒HA基因可能由北美猪流感病毒变异而来;3株病毒株HA基因与国内外甲型H1N1流感病毒高度同源,同全球绝大多数甲型H1N1流感病毒一样处于稳定状态.     

无锡地区流感病毒病原学监测及H3亚型血凝素基因变异研究

目的 监测无锡地区2005年至2008年季节性流感型与亚型分布并了解2008年部分A/H3N2分离株血凝素(8A)基因变异状况.方法 无锡地区医院门诊流感样患者及集体单位聚集性流感样暴发患者采集鼻咽拭标本,接种MDCK细胞,采用标准抗血清鉴定阳性分离株型与亚型,并对2008年部分H3亚型流感病毒进行HA全基因测序,分析HA基因变异状况.结果 2005年至2008年9月,在无锡地区流感样患者中共分离到435株流感病毒,其中164株为A/H1N1亚型,80株为MH3N2亚型,B型191株.型与亚型有明显季节性分布强弱特征.H3亚型HA序列分析,无锡地区9株分离株与上海地区同期分离株接近,有很多序列相互穿插归属于进化树的同一分支,与WHO 2008-2009年疫苗推荐株相近.结论 近年无锡地区散发和局部暴发流感病毒感染仍主要为A/H1N1、A/H3N2和B型,A/H3N2 HA基因与上海地区同期分离株接近,与WHO 2008-2009年疫苗推荐株相近.     

新生儿脐血Toll样受体变化及其意义

目的观察新生儿脐血单个核细胞（MNC）rrLR4、TLR2mRNA的表达。方法将46例无窒息新生儿及40例窒息新生儿根据胎龄分组,分离脐血MNC,测定其TLR4／2mRNA表达及上清中TNF-α水平。另外将TLR4／2mRNA表达水平与TNF-α水平进行相关分析。结果无窒息新生儿中足月儿TLR4／2mRNA及TNF-O／．水平分别为0．75±0．12、0．63±0．08、2502．6±273．1ng／t,胎龄≥32周但〈37周早产儿分别为0．37±0．04、0．32±0．03、1218．8±145．7ng／t,胎龄〈32周早产儿分别为0．26±0．03、0．20±0．03、811．8±105．2ng／t;窒息新生儿中足月儿TLR4／2mRNA及TNF-α．水平分别为0．58±0．07、0．50±0．06、1946．4±244．2ng／t,胎龄≥32周但〈37周早产儿分别为0．29±0．03、0．26±0．03、970．0±94．3ng／t,胎龄〈32周早产儿分别为0．17±0．02、0．14±0．02、652．6±60．3ng／t;成人TLR4／2mRNA及TNF-α水平分别为2．71±0．75、2．61±0．33、9270．1±1098．3ng／t。早产儿、足月儿TLR4／2mRNA及TNF-α水平均低于成人,胎龄越低,TLR4／2mRNA及TNF-α水平越低。窒息新生儿TLR4／2mRNA及TNF-α的表达水平均低于同胎龄无窒息新生儿（P〈0．01）。TLR4／2mRNA表达水平与TNF-O／．水平呈正相关关系。结论新生儿,特别是早产儿,TLR水平低下,可能是新生儿天然免疫能力低下,容易患败血症等严重感染性疾病的重要原因之一。     

冠心病患者血小板表面GPⅥ及活化分子的表达

目的 探讨冠心病患者血小板表面GPⅥ、CD62P和CD63的表达水平及其相互关系.方法 选择急性冠状动脉综合征患者43例、稳定性心绞痛患者21例及健康对照者33例,采用流式细胞术分别检测血小板表面GPⅥ、CD62P和CD63的表达水平,并作三者之间的相关性分析.结果 急性冠状动脉综合征组GPⅥ、CD62P及CD63较对照组(P分别为0.001、0.005和0.001)、稳定性心绞痛组显著升高(P分别为0.037、0.014和0.039),并且血小板表面GPⅥ的表达水平与CD62P和CD63的表达水平均呈明显正相关(r分别为0.712和0.633,P分别为0.001和0.001),相关分析证实CD62P及CD63表达的升高与心肌坏死标志物肌钙蛋白(r分别为0.256和0.291,P分别为0.021和0.008)及CK-MB(r分别为0.222和0.240,P分别为0.046和0.031)的升高相关.结论 急性冠状动脉综合征患者血小板表面GPⅥ、CD62P和CD63的表达水平明显升高,并且血小板表面GPⅥ的表达水平与CD62P和CD63的表达水平呈明显正相关,其表达水平的升高可能是预示急性冠状动脉综合征的重要指标.