茶多酚抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖及其机制的研究

目的 探讨茶多酚(Tea Polyphenols,TP)对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及其机制.方法 MTT比色法检测TP对HeLa细胞增殖的影响;荧光染色及DNA琼脂糖凝胶电泳分析等方法检测TP对HeLa细胞凋亡的影响;Western blot检测Bcl-2、Bax、P53蛋白表达.结果 TP处理HeLa细胞48 h后,细胞生长明显抑制,荧光染色可见明显的核固缩、碎裂现象;DNA凝胶电泳图谱观察到“梯子状”改变;随着药物浓度的增加,Bcl-2蛋白表达量下降,Bax、P53蛋白表达量增加.结论 TP抑制HeLa细胞的生长,诱导其凋亡,其作用机制可能是通过上调P53蛋白,直接激活Bax基因表达,同时抑制Bcl-2蛋白表达来诱导细胞凋亡.     

苦参碱诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡作用

目的:研究不同浓度的苦参碱(Mat)对宫颈癌Hela细胞株的体外增殖抑制作用。方法:采用体外细胞培养技术,以不同浓度的Mat作用于宫颈癌Hela细胞,相同条件下培养24h、48h、72h后,倒置显微镜观察细胞形态变化;MTT法测定Mat对Hela细胞的增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。结果:不同浓度Mat在体外均能不同程度抑制宫颈癌Hela细胞增殖,并且作用呈现时间-剂量依赖性;苦参碱诱导Hela细胞凋亡率增加。结论:Mat有抑制宫颈癌Hela细胞的增殖,诱导其凋亡作用。     

丙肝病毒siRNA表达载体构建及抗病毒作用研究

目的进行丙型肝炎病毒（HCV）RNA干扰（RNA interference RNAi）作用研究。方法本实验选择HCV NS3基因片段作为靶序列,合成含有靶序列的DNA片段并克隆到pGCsi-U6/Neo/GFP/siNeGative载体中,构建可表达具有发夹结构双链siRNA的真核表达质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/A,并转染Hela细胞,用HCV攻击该细胞,通过TCID50和HCV负链RT-PCR检测该载体对HCV感染细胞的保护效果。结果通过测序及荧光显微镜观察证明载体构建成功,实验组TCID50明显高于对照组,且RT-PCR结果显示pGCsi-U6/Neo/GFP/A转染组的HCV负链RNA表达量显著低于对照组。结论证实重组质粒表达产物能成功地使模型细胞中的HCV NS3基因沉默,并间接抑制了病毒的复制,本实验的成功无疑为HCV的治疗及蛋白功能的研究打下坚实的基础。     

国产虫草素对Hela细胞MMP-9、TIMP-1及TIMP-1 mRNA表达的调节

目的：观察国产虫草素对人宫颈癌Hela细胞生长,MMP-9,TIMP-1及TIMP-1mRNA表达的影响。方法：采用MTr法观察不同浓度的虫草素溶液（0,1,2,4mg／ml）对Hela细胞增殖抑制作用。人MMP-9／TIMP-1ELISA试剂盒及RT—PCR技术检测经不同浓度虫草素溶液（0,1,2,4mg／ml）处理后不同时间点（12,24,48h）Hela细胞MMP-9／TIMP-1及TIMP-1 mRNA表达的影响。结果：国产虫草素以剂量依赖方式抑制Hela细胞生长。不同浓度虫草素处理不同时问的Hela细胞分泌MMP-9呈轻度剂量依赖抑制方式,但未见统计学差异（P〉0．05）。可上调TIMP-1及其mRNA的表达,且呈明显剂量依赖方式,统计学差异显著（P〈0．05）,尤其在24h TIMP-1 mRNA的表达及蛋白分泌达最高峰。结论：国产虫草素可以以剂量依赖方式抑制肿瘤细胞的生长;可以通过上调TIMP—1 mRNA及蛋白的表达发挥潜在的抗肿瘤细胞侵润转移的作用,为国产新型抗肿瘤药物的临床研发及应用提供实验室依据。     

肿瘤放疗增敏药9401号的细胞毒性和体外放射增敏作用

目的 观察新的肿瘤放疗增敏药9401号对离体Hela细胞的细胞毒性和体外放射增敏作用。方法 采用细胞克隆形成法研究9401号的细胞毒性和放射增敏作用。结果 9401号对Hela细胞有较强的细胞毒性,随着药物浓度增加而增加,半数抑制剂量(ID₅₀)为4.65 mg/ml。用3 mg/ml的9401号药作用于Hela细胞3,6,12和24 h后,各组均可见放射增敏效应,相应的放射增敏比SERDO分别为1.33,1.5,1.63和1.67;SERDq分别为1.38,1.89,2.47和3.33;SERSF2分别为1.32,1.82,2.41和3.02。结论 9401号对Hela细胞的细胞毒性呈剂量依赖性关系。放射增敏作用明显,随药物作用时间延长而增强。     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

阿糖胞苷对子宫颈癌细胞的端粒酶活性的影响

目的 :探讨阿糖胞苷对体外培养的宫颈癌细胞 (Hela细胞 )端粒酶活性的影响。方法 :采用PCR ELISA法检测经阿糖胞苷处理前后的Hela细胞株端粒酶活性的改变。结果 :经阿糖胞苷处理后 ,Hela细胞的生长受到抑制 ,端粒酶活性明显降低。结论 :阿糖胞苷对Hela细胞具有生长抑制作用 ,其抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞的端粒酶活性有关。     

端粒酶催化亚基hTERT调控Hela细胞周期的实验研究

目的探讨hTERT基因与细胞周期因子之间的关系,从细胞周期调控的角度研究反义hTERT影响肿瘤细胞生长的机制。方法脂质体介导将hTERT反义寡核苷酸（hTERT-ASODN）转染到Hela细胞中,运用RT—PCR方法分析hTERT-ASODN对细胞周期相关基因表达水平的改变,流式细胞仪技术检测细胞周期分布的变化。结果hTERT—ASODN可在mRNA水平封闭Hela细胞中hTERT基因的表达,并使细胞周期相关基因如CyclinE1,CyclinB1,CyclinD1的表达水平出现明显变化。流式细胞仪的检测结果显示,hTERT-ASODN转染组的细胞数在G0／G1期增多,而在S期及G2／M期减少,但无特征性的凋亡峰出现。结论hTERT基因参与调控肿瘤细胞中相关细胞周期因子的表达。     

PDCD4在 Hela 细胞中过表达致抗凋亡蛋白 Bcl －2表达下调机制探讨

目的：探讨程序性细胞死亡因子4（PDCD4）的抑癌机制。方法：以含有全长 PDCD4的 cDNA 为模板,扩增 PDCD4全长基因,融合 PDCD4－GFP 融合基因真核表达载体,将其转染 Hela 细胞,采用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,以荧光定量 PCR 和 Western －blot 检测 PDCD4在细胞内的表达以及抗凋亡基因 Bcl －2的表达情况。结果：经酶切图谱分析、PCR 扩增及 DNA 测序证实融合基因真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内 PDCD4－GFP 融合蛋白的表达;RT －PCR 证实经 PDCD4基因转染的细胞内 PDCD4 mRNA 表达增高。PDCD4的过表达能够导致 Bcl －2基因表达下调。结论：PDCD4基因表达于宫颈癌细胞核和胞浆内,并且 PDCD4能够抑制 Bcl －2基因的表达水平。     

地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制探讨

目的 地西他滨(decitabine, DAC)具有较好的抗肿瘤活性,其分子机制与DNA去甲基化有关,本研究通过DAC对腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposiscoli,APC)基因的表达水平和去甲基化的影响,探讨DAC诱导宫颈腺癌Hela细胞凋亡分子机制.方法 不同浓度的DAC作用于宫颈腺癌Hela细胞24、36和48 h,MTT法检测对宫颈癌细胞的增殖抑制作用,观察DAC对Hela细胞增殖的浓度依赖效应和时间依赖效应.流式细胞术检测DAC对宫颈腺癌Hela细胞凋亡和细胞周期的影响.在DAC作用于宫颈腺癌Hela细胞前后,通过甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR, MSP)检测APC基因的甲基化状态;RT-PCR法检测APC基因mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测APC蛋白、β-catenin蛋白在胞内及核内表达的变化.结果 DAC对宫颈腺癌Hela细胞增殖抑制具有浓度依赖效应和时间依赖效应,Hela细胞半数抑制浓度(IC50) 24、36、48 h 分别为 28.23、7.65和5.64 μmol/L.DAC处理后的宫颈腺癌Hela细胞的凋亡率为(73.82±0.11)%,明显高于对照组的(12.41±0.24)%,P<0.001.DAC处理Hela细胞后,S期细胞比例(47.82±2.57)%和G2期细胞比例(30.87±2.28)%显著高于空白对照组的S期细胞比例(24.08±0.71)%和G2期细胞比例(2.52±0.84)%,P<0.001.DAC处理后,APC基因启动子区域去甲基化状态明显增高,APC mRNA表达量上升,处理前后比较差异有统计学意义,P<0.05.DAC处理后,胞内APC蛋白表达上调,而胞内和核内的β-catenin蛋白表达下调,差异均有统计学意义,P<0.05.结论 DAC可通过对APC基因的去甲基化作用,上调胞内APC蛋白表达,下调胞内和核内β-catenin表达,诱导宫颈癌细胞凋亡.